Institut:Biochemie/native PAGE

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Zur nicht-denaturierenden Proteinauftrennung.

[Bearbeiten] Methode

Basiert auf SDS-PAGE.

[Bearbeiten] Unterschiede zur SDS-PAGE

• WICHTIG! Probenvorbereitung ohne SDS-Zugabe und Denaturierung bei 95°C! (die Proteine sollen im nativen Zustand verbleiben)
• Nur mit Glasplatten-System
• Dünne Spacer und Kämme verwenden
• Trenngel polymerisiert in ca. 30 Minuten
• Gekühlte Laufkammer (4°C) verwenden
• Native PAGE Laufpuffer verwenden
• Stromgeber-Einstellungen:
• 1 Gel : 150 V (Gel läuft recht genau 90')
• 2 Gele : 200 V

[Bearbeiten] Materialien

Natives Trenngel 8,5% 10 ml 200 ml 3M TRIS pH 8.8 1,85 ml 37 ml 60% Saccharose 1,15 ml 23 ml 50% Acrylamid MQ 1,7 ml 5,3 ml 34 ml 106 ml 40% Acrylamid MQ 2,1 ml 4,9 ml 42 ml 98 ml 30% Acrylamid MQ 2,8 ml 4,2 ml 56 ml 84 ml	Natives Sammelgel 5% 10 ml 200 ml 0.5M TRIS, pH 6,8 2,5 ml 50 ml 50% Acrylamid MQ 1,0 ml 6,5 ml 20 ml 130 ml 40% Acrylamid MQ 1,2 ml 6,3 ml 24 ml 126 ml 30% Acrylamid MQ 1,6 ml 5,9 ml 33 ml 117 ml
Native PAGE Laufpuffer Laufpuffer 1× 5× 5×, 2L mM TRIS 50 mM 250 mM   60,6g mM Glycin 384 mM 1920 mM 288,3g	Probenpuffer Probenpuffer 4× 4×, 100µl 0,5 M EDTA 250 mM 50 µl 0,5 M Tris pH 6,8 375 mM 12,5 µl 60% Saccharose 16,5% 27,5 µl 1 M DTT 0,1 M 10 µl etwas Bromphenolblau