Institut:Biochemie/Konzentrationsbestimmung von Proteinen

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Bradford (für 2 bis 8 µg Protein)

Die Proteinkonzentration wird bei dieser Methode photometrisch bei einer Analysenwellenlänge von λ=595 nm gemessen. Dazu werden 100 µl der Proteinlösung unbekannter Konzentration und jeweils 100 µl von BSA-Eichlösungen (10^-3 bis 5*10^-2 µg/µl) mit jeweils 100 µl Bradford-Färbereagenz in einer Mikrotiterplatte für 5 min. bei RT inkubiert. Anschließend wird in einem "Microplate Reader" die Absorption des Komplexes aus Protein und Färbereagenz bestimmt. Mithilfe der BSA-Eichgrade kann die Konzentration der zu analysierenden Proteinprobe ermittelt werden.

Bradford-Färbelösung

in MQ	Endkonzentration	100 ml
Coomassie Brilliant Blue G250/ Serva Blue G	0,06%	60 mg
Perchlorsäure (HClO4), 70%	1,9%	2,7 ml
lichtgeschützt aufbewahren

Bradford-Färbelösung, Variante für kleine Proteinmengen (0,1-1,0 µg/µl)

Verwendung: Protein in 10µL MQ vorlegen und mit 250µL Bradfordreagenz auffüllen. 15' bei RT stehen lassen und photometrisch bei λ=595 nm analysieren.
TIPP: Coomassie zunächst in EtOH lösen, da in MQ nur schlecht löslich.
Mikrotiterplatte verwenden! ->Spart die große Höllenarbeit und Küvettenschieberei.

Protokoll nach Yelena Sofina added 28-Aug-2005 Alexander Krupp

in MQ	Endkonzentration	500 ml
Coomassie Brilliant Blue G250/ Serva Blue G	0,004%	20 mg
EtOH(96%)	~5,0% (v/v)	25 ml
Phosphorsäure (H3PO4), 85%(v/v)	8,5%	50 ml
lichtgeschützt bei 4°C aufbewahren

SPOT-Test

1. Für die 12 BSA-Standards und die aufzutragenden Proben werden je zwei Felder (1x1 cm) mit Bleistift auf Munktell-Filterpapier gezeichnet (Papier nur mit Handschuhen und nur an den Ecken anfassen!).
2. In die Mitte jedes Feldes wird 1 µl Standard bzw. Probe aufgetragen.
3. Wenn die Standards in aufsteigender Reihenfolge aufgetragen werden, kann die selbe Pipettenspitze verwendet werden.
4. Kurz eintrocknen lassen.
5. Das Papier wird kurz in die Färbelösung getaucht.
6. Das Papier wird in Entfärbelösung auf einen Schüttler gelegt. Wenn die Entfärbelösung blau wird, muss sie durch frische ersetzt werden.

Lösungen

Für 500 ml	Färbelösung	Entfärbelösung
Methanol (technisches)	50 ml	50 ml
Essigsäure	35 ml	35 ml
0,25% Coomassie Brilliant Blue G250 oder Serva Blue G	1,25 g

BSA-Standards

500 µl Aliquots : 7,5 mg BSA mit MQ auf 1,5 ml auffüllen

µl Mischung	µl MQ	Endkonzentration (µg/µl)
500	0	5,0
200	300	2,0
100	400	1,0
90	410	0,9
80	420	0,8
70	430	0,7
60	440	0,6
50	450	0,5
40	460	0,4
30	470	0,3
20	480	0,2
10	490	0,1