Institut:Biochemie/Nickel-Chelatreinigung

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Methode[Bearbeiten]

  1. leere Säule und Teflon-Einlage mit MQ und Ethanol spülen
  2. 3ml an Nickel-Chelat-Matrix (Resuspendiert in EtOH) einfüllen
  3. Säulenmatrix mit 5×8ml Säulenvolumen Puffer A äquilibrieren
  4. Lysat mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min über die Säulenmatrix geben
  5. Matrix mit 5× 8ml Säulenvolumen Puffer B bei einer Geschwindigkeit von 1ml/min waschen
  6. im letzten Schritt den Überstand über der Matrix FAST ganz ablaufen lassen (aber nicht trocken laufen lassen). Über der Matrix darf nur wenig Volumen Puffer stehen, sonst wird das Protein nur dünn eluiert
  7. Elution mit 5x 1ml Puffer C
  8. Eluate durch Spottest auf Proteingehalt testen
  9. Lagerung der proteinhaltigen Eluate bei –20°C aus.

Material[Bearbeiten]

Puffer A (0,5 l) Puffer B (0,5 l) Puffer C (0,2 l)
Tris (MW=121.14) 3,03 g (EK 50 mM) 3,03 g (EK 50 mM) 1,21 g (EK 50 mM)
NaCl (MW=58.44) 4,38 g (EK 0,15M) 4,38 g (EK 0,15M) 1,75 g (EK 0,15M)
Imidazol (MW=68,08) 0,68 g (EK 20mM) 1,7 g (EK 50mM) 2,72 g (EK 200mM)
einstellen auf pH 8,0 8,0 8,0
mit HCl HCl HCl