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Institut:Biochemie/Plasmid-DNA-Isolation aus E. coli

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Zur Reinigung kleiner DNA-Mengen aus E. coli.

Alkalische Lyse (nach Zhou)

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Einfach, schnell und preiswert. Gut für Kontrollen.

  1. NaOAc und EtOH 70% in den Kühlschrank stellen
  2. 1,5 ml einer Übernachtkultur in Eppi geben
  3. In der Tischzentrifuge bei 10.400 g (11.000 rpm) ca. 10 sec anzentrifugieren
  4. Überstand (bis auf ca. 50 µl) verwerfen
  5. vortexen
  6. 300 µl TNES-Puffer dazu geben
  7. vortexen (2-5 sec), bis die Lösung zäh wird
  8. kurz auf Eis stellen (optional)
  9. 150 µl NaOAc kalt dazugeben
  10. vortexen (2-5 sec)
  11. Zentrifugieren bei 10.400 g (11.000 rpm) für 15 min
  12. Überstand in frische Eppis geben, Pellet verwerfen
  13. 900 µl EtOH 100% -20°C dazugeben
  14. 2 µl Glykogen dazugeben (optional, macht die DNA besser sichtbar)
  15. vortexen
  16. kurz auf Eis stellen (optional)
  17. Zentrifugieren bei 10.400 g (11.000 rpm) für 25 min
  18. Überstand verwerfen, ggfs. in einem anderen Eppi zur Sicherheit aufbewahren
  19. 750 µl EtOH 70% kalt dazugeben
  20. Zentrifugieren bei 10.400 g (11.000 rpm) für 2 min
  21. Überstand verwerfen, ggfs. in einem anderen Eppi zur Sicherheit aufbewahren
  22. Pellet 5 min and der Luft trocknen lassen
  23. Pellet in 30 µl S1-Puffer (mit RNAse!) geben
  24. Bei -20°C aufbewahren

Materialien

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  • S1-Puffer
  • TNES-Puffer
  • EtOH 100% -20°C
  • EtOH 70% kalt
  • Eis
  • NaOAc 3M pH 5.2 kalt (1,23 g auf 5 ml MQ. mit HClkonz einstellen)

"10 Minuten"-Methode

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  1. 1,5 ml Übernachtkultur zentrifugieren (1 min, 10.000g)
  2. Überstand verwerfen (bis auf ca. 50-100µl)
  3. Pellet resuspendieren, 300 µl frisch angesetzten TNES-Puffer zugeben
  4. 4× invertieren
  5. 150 µl 3M NaOAC (pH 5) dazugeben
  6. 4× invertieren
  7. zentrifugieren (10 min, max rpm)
  8. Überstand in neues Eppi transferieren, Pellet verwerfen
  9. Zum Überstand 900 µl 100% EtOH dazugeben
  10. zentrifugieren (15 min, max rpm)
  11. Überstand verwerfen
  12. 750 µl 70% EtOH hinzugeben
  13. zentrifugieren (5 min, max rpm)
  14. Überstand verwerfen
  15. Pellet in 50-100 µl S1-Puffer (mit RNAse!) aufnehmen

Materialien

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  • TNES-Puffer, 3M NaOAC (pH 5), EtOH 100%, EtOH 70%, S1-Puffer
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