Herstellung kompetenter Bakterien

Chemisch kompetente Bakterien[Bearbeiten]

Zellwand und Plasmamembran der Bakterien müssen permeabilisiert werden, um eine effektive Aufnahme von DNA in die Zellen zu gewährleisten. Die Effizienz der Transformation ist während der logarithmischen Wachstumsphase einer Bakteriensuspension am höchsten, wobei zirkuläre DNA um einen Faktor 102-103 besser aufgenommen wird als lineare.

5 ml LB-Amp^--Medium wird mit Bakterien aus einem Glycerolstock angeimpft. Die Kultur wird über Nacht bei 37°C/220 rpm inkubiert.
Aliquots (100 µl, 500µl, 1 ml) der Kultur werden in Petrischalen mit 100 mm Durchmesser auf LB-Amp^--Agar ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Eine Bakterienkolonie wird am nächsten Tag in 5 ml LB-Amp^--Medium überführt. Diese Startkultur wird für 5 h bei 37°C/220 rpm inkubiert.
Mit 1 ml der Startkultur werden 100 ml LB-Amp^--Medium angeimpft; Inkubation über Nacht bei 37°C/180 rpm.
Am nächsten Tag werden mit 1 ml der ÜNK 100 ml LB-Amp^--Medium angeimpft. Die Kultur wird bei 37°C/180 rpm inkubiert, bis eine Absorption A600 nm von 0,5 erreicht wird (nach ca. 2-3 h).
Inkubation der Bakteriensuspension für 20 min auf Eis.
Zentrifugation der Bakteriensuspension für 5 min bei 4°C und 1200X g
Resuspension des Bakteriensediments in 10 ml kalter TSS-Lösung. Aliquots (100 µl) der kompetenten Bakterien werden nach Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff bei -80°C aufbewahrt, und bleiben 2 Monate transformierbar.

Materialien[Bearbeiten]

TSS

85 % LB-Medium,
10 % (w/v) PEG 8000,
5 % (v/v) DMSO,
50 mM MgCl₂
pH 6,5
sterilfiltrieren

Elektrokompetente Bakterien[Bearbeiten]

Für die Transformation von Bakterien durch Elektroporation muss die Bakteriensuspension einen niedrigen Salzgehalt haben, um ein zu schnelles Abfallen der angelegten Spannung, und damit eine ineffiziente Transformation, zu vermeiden.

500 ml LB-Amp^--Medium werden mit 5 ml einer ÜNK angeimpft und bei 37°C/180 rpm inkubiert, bis eine Absorption A600 nm von 0,5 erreicht wird.

Je nach Bakterienstamm muss auch zur Herstellung elektrokompetenter Baccis eine Antibiose zugesetzt werden. Bei BL21-RIPL müssen z.B. 35µg/ml Chloramphenicol eingesetzt werden, um das für RIPL kodierende Plasmid im Stamm zu erhalten.
OBACHT bei BL-21:
Der Stamm BL-21 wächst deutlich langsamer als z.B. DH5 -> In der Planung bedenken & ggf. größeres Ü/N-Volumen zum Animpfen benutzen.

Inkubation der Bakteriensuspension für 20 min auf Eis.
Zentrifugation der Bakteriensuspension für 15 min bei 4°C und 4000X g
Bakteriensediment in 500 ml gekühlten, sterilen Wasser resuspendieren, kurz mischen. Zentrifugation der Bakteriensuspension für 15 min bei 4°C und 4000X g.
Bakteriensediment in 250 ml gekühlten, sterilen Wasser resuspendieren, kurz mischen. Zentrifugation der Bakteriensuspension für 15 min bei 4°C/4000X g.
Bakteriensediment in 10 ml sterilen 10 % (v/v) Glycerin resuspendieren, kurz mischen. Zentrifugation der Bakteriensuspension für 15 min bei 4°C/4000X g.
Bakteriensediment in 1,5 ml sterilen 10 % (v/v) Glycerin resuspendieren, kurz mischen. Aliquots (50 µl) der kompetenten Bakterien werden nach Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff bei -80°C aufbewahrt, und bleiben 2 Monate transformierbar.