Zur nicht-denaturierenden Proteinauftrennung.
Basiert auf SDS-PAGE.
Unterschiede zur SDS-PAGE[Bearbeiten]
- WICHTIG! Probenvorbereitung ohne SDS-Zugabe und Denaturierung bei 95°C! (die Proteine sollen im nativen Zustand verbleiben)
- Nur mit Glasplatten-System
- Dünne Spacer und Kämme verwenden
- Trenngel polymerisiert in ca. 30 Minuten
- Gekühlte Laufkammer (4°C) verwenden
- Native PAGE Laufpuffer verwenden
- Stromgeber-Einstellungen:
- 1 Gel : 150 V (Gel läuft recht genau 90')
- 2 Gele : 200 V
Natives Trenngel
| 8,5%
|
10 ml
|
200 ml
|
| 3M TRIS pH 8.8
|
1,85 ml
|
37 ml
|
| 60% Saccharose
|
1,15 ml
|
23 ml
|
50% Acrylamid
MQ
|
1,7 ml
5,3 ml
|
34 ml
106 ml
|
40% Acrylamid
MQ
|
2,1 ml
4,9 ml
|
42 ml
98 ml
|
30% Acrylamid
MQ
|
2,8 ml
4,2 ml
|
56 ml
84 ml
|
|
Natives Sammelgel
| 5%
|
10 ml
|
200 ml
|
| 0.5M TRIS, pH 6,8
|
2,5 ml
|
50 ml
|
50% Acrylamid
MQ
|
1,0 ml
6,5 ml
|
20 ml
130 ml
|
40% Acrylamid
MQ
|
1,2 ml
6,3 ml
|
24 ml
126 ml
|
30% Acrylamid
MQ
|
1,6 ml
5,9 ml
|
33 ml
117 ml
|
|
Native PAGE Laufpuffer
| Laufpuffer
|
1×
|
5×
|
5×, 2L
|
| mM TRIS
|
50 mM
|
250 mM
|
60,6g
|
| mM Glycin
|
384 mM
|
1920 mM
|
288,3g
|
|
Probenpuffer
| Probenpuffer
|
4×
|
4×, 100µl
|
| 0,5 M EDTA
|
250 mM
|
50 µl
|
| 0,5 M Tris pH 6,8
|
375 mM
|
12,5 µl
|
| 60% Saccharose
|
16,5%
|
27,5 µl
|
| 1 M DTT
|
0,1 M
|
10 µl
|
| etwas Bromphenolblau
|
|
