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- IGF 2 µg/µl, 34 kDa
- Peptid 1,5 µg/µl, 5 kDa
- 6 verschiedene molare Verhältnisse (1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100)
- 5 verschiedene Zeiten (0, 5, 15, 30, 60 Minuten)
- Reaktion findet bei Raumtemperatur statt
Konzentration (in picoMol)
| Cx [pmol/µl]= |
1.000 * Cx [µg/µl] |
|
| MWx [kDa] |
Daher:
- IGF : 58,8 pmol/µl
- Peptid : 300 pmol/µl
Endkonzentration IGF soll 2 µM/µl betragen
70 µl je Ansatz (5 Zeitwerte + 2 zur Sicherheit, je 10 µl)
Berechnung der µl IGF pro Ansatz
| x = |
2 µM * 70 µl |
= 2,38 µl = ca. 2,4 µl |
|
| 58,8 pmol/µl |
6 Ansätze à 70 µl
| IGF:Peptid |
IGF |
Peptid |
KP |
TRIS |
| 1:1 |
2,4 µl |
0,4 µl |
7 µl |
60,2 µl |
| 1:10 |
2,4 µl |
4,6 µl |
7 µl |
56,0 µl |
| 1:20 |
2,4 µl |
9,3 µl |
7 µl |
51,3 µl |
| 1:30 |
2,4 µl |
14,0 µl |
7 µl |
46,6 µl |
| 1:50 |
2,4 µl |
23,3 µl |
7 µl |
37,3 µl |
| 1:100 |
2,4 µl |
46,6 µl |
7 µl |
14,0 µl |
TRIS : 50mM pH7.5; KP = 10× Kinasepuffer
IGF:Peptid meint das molare Verhältnis |
- 5 Zeitwerte × 6 molare Verhältnisse = 30 Eppis vorbereiten, SDS-Probenpuffer oder Quenching-Puffer (für native Gelelektrophorese) in jedes Eppi geben
- Alles bis auf Kinasepuffer zusammenpipettieren
- Ggfs. Nullwerte (Zeit=0) entnehmen (nur 6 µl)
- Zeit startet bei der Zugabe von Kinasepuffer; festes Zeitschema wählen (z.B. 20 Sekunden pro Ansatz)
- Bei jedem Zeitwert aus jedem Ansatz 10 µl entnehmen (Zeitschema beachten), in vorbereitetes Eppi geben, ggfs. kurz anzentrifugieren (bei Verwendung von Quenching-Puffer Eppi auf Eis stellen)
- Die Proben können über Nacht bei -20°C gelagert werden
| 10× |
100 µl |
| ATP 100 mM |
20 µl 0,5M oder 40 µl 0,25M |
| MgCl2 200 mM |
30 µl 1M |
| TRIS pH 7.5 50 mM |
10 µl 0,5M |
| DTT 10 mM |
1 µl 1M |
| TRIS |
39 (bzw. 19) µl 50mM pH 7.5 |
| !ATP in 50 mM TRIS oder HEPES auf pH 7.0 einstellen! |
|
| 4× |
100 µl |
10 ml |
| EDTA 0,5M |
50 µl |
5 ml |
| TRIS 3M |
12,5 µl |
1,25 ml |
| 1M DTT |
10 µl |
1 ml |
| Saccharose 60% |
26,5 µl |
2,65 ml |
| 1% Bromphenolblau |
1 µl |
100 µl |
|
