Institut:Biochemie/Triton-PAGE

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Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen.

Die Triton-PAGE ist eine Methode zwischen der klassischen SDS-PAGE und der native PAGE. Auch hier werden Proteine eher nach sekundären Kriterien, wie Ladung, Glykosilierung und Struktur aufgetrennt.

[Bearbeiten] Methode

1. 10 ml Trenngel (+APS +TEMED) in Kassette geben
2. mit etwas MQ bedecken
3. warten bis das Gel fest wird (ca. 45 min)
4. MQ abgießen oder mit Filterpapier entfernen
5. Kassette mit Sammelgel (+APS +TEMED) füllen (ca. 5 ml)
6. Kamm einsetzen
7. warten bis das Gel fest wird (ca. 30 min)
8. Unterseite der Slots mit Stift markieren
9. Kamm und Klebestreifen entfernen
10. Kassette in Laufkammer stellen (Slots zur Mitte hin orientieren)
11. Mitte der Laufkammer mit Nativem-Laufpuffer füllen, so dass die Slots bedeckt sind; es darf kein Puffer auslaufen
12. den äußeren Bereich der Kammer zu etwa 1/3 mit Laufpuffer füllen
13. Proben mit Hamilton-Pipette in die Slots geben, nach jeder Probe in Laufpuffer spülen
14. Laufzeit 90-120min bei 150mA bei 4°C
15. Hamiltonpipette mit Ethanol spülen
16. Gel entfernen, wenn die Lauffront sich dem unteren Ende nähert
17. Kammer in den Ausguss entleeren, mit Wasser spülen

Weitere mögliche Schritte:

• Gel auf Lichttisch fotographieren
• Western Blot
• Gel trocknen
  1. Gel und Einmach-Folie in MQ legen
  2. Gel auf die feuchte Folie legen, Folie umklappen, so daß sie das Gel von beiden Seiten komplett bedeckt
  3. Gel in Folie zwischen zwei Pappdeckel legen
  4. auf Vakuumtisch legen, Vakuumpumpe einschalten (Waschflasche auf Eis stellen!)
  5. mit Vakuum für ca. 1 h mit Hitze, danach für ca. 15 min ohne Hitze trocknen
  6. falls das Gel zu früh entnommen wird (wellig), ca. 1 h in MQ einlegen, erneut trocknen

[Bearbeiten] Materialien

Natives Trenngel 8,5% 10 ml 200 ml 3M TRIS pH 8.8 1,85 ml 37 ml 20% Trition X-100 50 µl 1 ml 60% Saccharose 1,15 ml 23 ml 50% Acrylamid MQ 1,7 ml 5,3 ml 34 ml 106 ml 40% Acrylamid MQ 2,1 ml 4,9 ml 42 ml 98 ml 30% Acrylamid MQ 2,8 ml 4,2 ml 56 ml 84 ml	Natives Sammelgel 5% 10 ml 200 ml 0.5M TRIS, pH 6,8 2,5 ml 50 ml 20% Trition X-100 50 µl 1 ml 50% Acrylamid MQ 1,0 ml 6,5 ml 20 ml 130 ml 40% Acrylamid MQ 1,2 ml 6,3 ml 24 ml 126 ml 30% Acrylamid MQ 1,6 ml 5,9 ml 33 ml 117 ml
Native PAGE Laufpuffer Laufpuffer 1× 5× 5×, 2L mM TRIS 50 mM 250 mM   60,6g mM Glycin 384 mM 1920 mM 288,3g	Probenpuffer Probenpuffer 4× 4×, 100µl 0,5 M EDTA 250 mM 50 µl 0,5 M Tris pH 6,8 375 mM 12,5 µl 60% Saccharose 16,5% 27,5 µl 1 M DTT 0,1 M 10 µl 20% Trition X-100 0,1 % 0,5 µl etwas Bromphenolblau

[Bearbeiten] Andere Materialien

• APS=40% Ammonium-Persulfat (0,1g auf 250 µl ansetzen, hält ca. 2-3 Tage)
• ggfs. Einmach-Folie