Gekoppelter Assay

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Die Phosphorylierung ist eine optisch inaktive Reaktion, daher wird sie durch die Kopplung an den Abbau von NADH, eine optisch aktive Reaktion, übers Photometer detektierbar.

  • Kinase: ATP + S --> Kinase + ADP + pS
  • Pyrovat-Kinase: ADP + PEP --> ATP + Pyrovat
  • Lactat-Dehydrogenase: Pyrovat + NADH + H+ --> NAD+ + Lactat

Gemessen wird die Abnahme der Konzentration an NADH anhand der Abnahme der OD340. Die Umrechnung in den Transfer erfolgt mit dem Lambert-Beer Gesetz:

  • OD340 = E340 (NADH) * c * d

E340 (NADH) = 6,22 d = 1cm

Messung am Photometer im Zentrifugenraum:

  • Programm: Kinetics/Time
  • Dateiname eingeben (Unter B:)
  • λ= 340nm, Backround: (no) 250nm
  • Interval time: 20 s, Messzeit: 30-40 min
  • T = 22 °C
  • Tabulation/Plot: auswählen, ob lieber Graph oder Tabelle (besser Tabelle) (ist während der Messung nicht umstellbar)
  • Gemessen wird in der 250 µl Quarz-Küvette
  • Küvette wird mit 250 µl Tris geblanct.

Stock- Lösungen:

  • LDH: 25000 u/1,4 ml --> 4,5 µl auf 250 µl Ansatz
  • PK: 10 mg/ml --> 5,7 µl auf 250 µl Ansatz
  • PEP: 10 mM (2 mg/ml) --> 25 µl in 250 µl Ansatz
  • NADH 10 mM (7 mg/ml) --> 6 µl in 250 µl Ansatz
  • MgCl2 1 M --> 7,5 µl in 250 µl Ansatz
  • DTT 100 mM --> 2,5 µl in 250 µl Ansatz
  • ATP 100 mM --> je nach Ansatz
  • ADP 100 mM --> 1-2 µl in 250 µl Ansatz
  • Tyrtide 555 µM --> 90 µl (200 µM)in 250 µl Ansatz

Da die Reaktion bei Raumtemperatur stattfindet, sollten die Lösungen mit großem Volumen auf Raumtemperatur sein (Tris, MgCl2 und Tyrtide), alles andere auf Eis!

Messung

  • Alles in die Küvette geben, außer Kinase und ATP und gut mit dem Enzymlöffel mischen.
  • Küvette genau wie den Blanc-Wert reinstellen und starten (Read sample), OD sollte so zwischen 1,2 und 1,5 liegen.
  • ATP und Kinase handwarm machen.
  • Warten, bis die OD einigermaßen konstant ist und dann ATP zugeben, umrühren und eine Messung mit Enzymlöffel in der Lösung (An dem * Ausschlag in der OD kann man später erkennen, wann ATP zugegeben wurde).
  • Warten, bis die OD einigermaßen konstant ist und dann Kinase zugeben, umrühren und eine Messung mit Enzymlöffel in der Lösung (s.o.).
  • 15 Minuten messen, dann durch Zugabe von ADP stoppen (OD sollte auf 0,5-0,1 runter gehen).

Speichern

  • Dann auf Save/Clear Daten Speichern auf Diskette (B:/) und Namen eingeben.
  • Quit (Methode nicht speichern)
  • Auf File Utilities, unter KinData die Datei markieren und auf Convert klicken (Darauf achten, dass Destination B: angegeben ist.