Kurs:Biochemisches Praktikum für Fortgeschrittene

Ziel des Kurses

Ziele dieses Praktikums sind das Erlernen genereller Klonierungsmethoden, sowie Methoden der Proteinreinigung. Im Laufe des Praktikums soll des weiteren die Herangehensweise an Wissenschaftliche Fragestellungen trainiert werden

Voraussetzungen

Man sollte schon einmal einen einfachen Pipetierkurs gemacht haben

Autoren

Gismo

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Klausur

Der Kurs enthält Kernfragen, die beantwortet werden sollten

Weiterführende Kurse

Folgt in Kürze

Willkommen im Kurs

Biochemisches Praktikum für Fortgeschrittene

Einleitung

Insulinrezeptor-Substrate

Die Insulinrezeptor-Substrate (IRS) besitzen eine Schlüsselrolle im Insulinrezeptor-Signalweg und können multipel an Serin, Threonin und Tyrosin phosphoryliert werden. Die IR-Substrate stellen das Bindeglied zwischen Rezeptor und der Zellantwort dar, und werden daher oft als Gerüst- oder Adapterproteine bezeichnet (engl.: scaffolding/adaptor proteins). Die IRS-Proteine besitzen zahlreiche Bindestellen für Effektormoleküle mit SH2 Domänen wie z. B. die regulatorische Untereinheit (p85) der PI3-Kinase, die c-SRC spezifische Kinase (CSK), die tyrosinspezifische Proteinphosphatase SHP 2, kleinere Moleküle wie GRB2 („growth factor binding protein 2“) oder Adaptormoleküle wie z.B. CRK und NCK ^[1]. Die Bindung dieser Effektorproteine setzt Signalkaskaden in Gang, die zur Aktivierung vieler Effektoren der Insulinsignalweiterleitung führen. Die IRS besitzen eine N-terminale Pleckstrin Homologie Domäne (PH Domäne), die an Phospholipide binden kann und das Protein zur Plasmamembran bringt, eine Phosphotyrosin-bindende Domäne (PTB Domäne), die an der Erkennung und der Bindung von NPXpY Motiven beteiligt ist, einen Linker zwischen PTB- und C-terminaler Domäne und einen weniger konservierten C-Terminus mit verschiedenen Phosphotyrosinmotiven (pY), an die weitere Effektoren binden können. Es sind bis heute sechs verschiedene IRS-Moleküle (IRS-1 bis IRS-6) bekannt, die phylogenetisch sehr ähnlich sind und viele strukturelle Übereinstimmungen aufweisen. Trotzdem zeigen die verschiedenen Isoformen Unterschiede in ihren Phosphorylierungsmotiven, in ihrer gewebsspezifischen Verteilung, ihrer Bindung an den Insulinrezeptor und ihrer subzellulären Lokalisation. Bisher sind erst wenige Funktionen der IRS-Moleküle in der Signalweiterleitung aufgeklärt.

Das Insulinrezeptor-Substrat 1 (IRS-1)

Das Insulinrezeptor-Substrat 1 wurde erstmals in Rattenleberzellen identifiziert und ist das bisher am besten untersuchte Insulinrezeptor-Substrat. Sein Molekulargewicht beträgt 131 kDa, zeigt aber nach Isolierung aus verschiedenen Zelltypen aufgrund basaler Tyrosin- und Serinphosphorylierung sowie Glykosylierung in der SDS-PAGE ein höheres apparentes Molekulargewicht (165 – 170 kDa), nach Insulinstimulation bis 180 kDa^[2]. Es ist an der Differenzierung brauner Adipocyten, der Insulinsekretion durch β-Zellen und am Glukosetransport in Muskelzellen beteiligt^[2]^[3]^[4]. Das IRS-1 aus der Ratte (Rattus norvegicus) enthält 1235 Aminosäurereste (AS), das des Menschen 1242 AS. Diese Differenz in der Anzahl der AS führt zu Unterschieden in der Nomenklatur der beiden Isoformen, deren Sequenzhomologie 90 % beträgt. In der Sequenz befinden sich 34 Tyrosin-, 63 Threonin- und 181 Serinreste. Folglich enthält jeder vierte Aminosäurerest eine theoretisch phosphorylierbare Hydroxylgruppe. 21 Tyrosinreste liegen in potentiellen Erkennungssequenzen für verschiedene Tyrosinkinasen. Durch Edman-Sequenzierung radioaktiv markierter IRS-1 wurden mindestens 8 insulinabhängige Phosphorylierungsstellen identifiziert[Sun:1993oa]. Das IRS-1 enthält über 50 Konsensussequenzen für Proteinkinasen[Greene:2002oz] . Drei dieser Konsensussequenzen sind bei humanem IRS-1 Erkennungsstellen für die Proteinkinase B (PKB, auch: Akt). Das Besondere an den verschiedenen Tyrosinen in den Erkennungssequenzen für die Tyrosinkinasen ist, dass 6 von ihnen in YMXM Motiven liegen und 2 in YXXM Motiven. Für die Interaktion mit einer Tyrosinkinase ist ein Methioninrest in Position Y+1 und Y+3 sehr viel wichtiger, als der Säurerest, der N-terminal des Tyrosins gelegen ist und der Auswirkung auf die katalytische Effizienz hat. Der Aminosäurerest an Position Y+2 scheint dagegen relativ variable zu sein, denn Studien mit Prolin, Methionin, Asparagin oder Threonin haben keine signifikanten Unterschiede nachweisen können. Das führt zu der Annahme, dass die YMXM Motive zum einen Erkennungssequenzen für die PI-3 Kinase und andere SH2-haltige Proteine sind und damit die Erkennung und Phosphorylierung durch den Insulinrezeptor ermöglichen. Vier dieser 6 YMXM Motive besitzen ein Serin an Position Y+4 und ein Prolin an Position Y+5 in der Aminosäuresequenz des IRS-1. Studien mit Proteinen, die andere Aminosäuren an diesen Positionen haben, zeigten aber eine gleich starke Phosphorylierungseffienz von Rezeptor und ihrer subzellulären Lokalisation. Bisher sind erst wenige Funktionen der IRS-Moleküle in der Signalweiterleitung aufgeklärt.

Die Rolle des Insulinrezeptor-Substrates 1

Obwohl vermutlich jedes an Insulinrezeptorsubstrat-1 assoziierte Protein eine Rolle spielt, lässt sich durch Untersuchungen an transgenen Mäusen zeigen, dass über IRS-1 und IRS-2 die meisten Insulinantworten gesteuert werden[White:2002ai]. Abbildung 2 zeigt schematisch die Schlüsselrolle des IRS-1 in der Insulinsignalweiterleitung. Das IRS-1 stellt das Bindeglied zwischen IR und zwei der wichtigsten Zellantworten auf die Insulinbindung an den Rezeptor dar: die Aktivierung der „mitogen activated Protein Kinase“ (MAPK) und die Aktivierung der Phosphoinositol-3 Kinase (PI3-K). Der MAPK- Weg wird aktiviert, indem Grb2 an tyrosinphosphoryliertes IRS-1 bindet. „Son of sevenless“ (SOS), das mit Grb2 assoziiert ist, katalysiert den Austausch von an Ras gebundenem GDP zu GTP[Skolnik:1993tw][Walker:1998cq]. Das dadurch aktivierte Ras kann so an den aminoterminalen Teil von Raf binden, welches dadurch transloziert wird[Pronk:1994ye]. Gleichzeitig dissoziieren Raf gebundene 14-3-3 Proteine und es werden mögliche Serinstellen für die Phosphorylierung durch verschiedene Ser/Thr Kinasen frei[Roy:1998qf]. Als aktivierte Serinkinase phosphoryliert Raf nun die MAPK/Erk-Kinase 1 (MEK 1). Die MEK 1 phosphoryliert wiederum die „extracellular signal-regulated kinases“ 1 und 2 (ERK1/2) an Tyrosin- und Threoninresten[Crews:1992cs][Marshall:1995dp]. Erk 1 und 2 gehören zur Familie der MAP-Kinasen. Über die MAP-Kinasen werden z.B. die Phospholipase A oder Transkriptionsfaktoren wie Elk-1 phosphoryliert und damit Genexpression reguliert. Über die Wirkung von Erk1und 2 ist bisher sehr wenig bekannt. Der zweite Hauptweg beginnt indem p85, die regulatorische Untereinheit der PI3-Kinase, an IRS-1 bindet und die PI3-Kinase aktiviert wird. Die katalytische Untereinheit beschleunigt die Phosphorylierung von Phosphoinositen an der D3 Position des Inositolrings. Das enstehende Produkt, Phosphatidylinositol 3,4,5 – triphosphat (PIP3)[Nave:1996dk] bindet an die PH-Domäne der Phosphoinositol-abhängigen Kinase 1 (PDK1)[Walker:1998cq] , und an die PKB (Akt), wodurch die PDK1 aktiviert wird. Diese aktiviert wiederum die Akt-Kinase. Die Stimulation erfolgt über die Phosphorylierung an Akt-Kinase Thr308 und Ser473 durch PDK-1 und -2. Über die Akt-Kinase führen die Signalwege zur Proteinsynthese und Genexpression über die p70 ribosomale S6-Kinase, zur Glykogensynthase über GSK-1 und zur Glukoseaufnahme über den GluT4-Transporter. Shp2 ist nach Insulinstimulation ebenfalls mit IRS-1 assoziiert[Matozaki:1996fy]. Dessen genaue Funktionen sind bisher aber ungeklärt.

Modulation von IRS-1 durch Tyrosin und Serin/Threonin Phosphorylierung

Die beiden Hauptwege der Insulinsignalkaskade werden durch das IRS-1 koordiniert. Für die Signalweiterleitung sind die Bindung und die damit verbundene Phosphorylierung von Effektoren an phosphorylierte Tyrosinreste des IRS-1 essentiell. Die Modulation dieser Schlüsselrolle kann entweder durch die Tyrosindephosphorylierung durch Tyrosinphosphatasen oder durch die Phosphorylierung an Serin/Threonin Resten des IRS-1 verursacht werde[Tanti:1994il] [Folli:1997vl]. IRS-1 enthält über 50 Serin/Threonin Phosphorylierungskonsensusstellen für Serin/Threonin Kinasen wie z.B. PKC-Isoformen, Caseinkinase II, MAPK, Glycogen Synthase Kinase, PKA und PKB/Akt. Es gibt jedoch Hinweise, dass basale Serin und Threonin Phosphorylierungen am IRS-1 eine induzierende Rolle, Hyperphosphorylierung dieser Ser/Thr Stellen hingegen eine hemmende Funktion auf die Weiterleitung des Insulinsignals ausüben. In vitro konnte gezeigt werden, dass durch eine alkalische Phosphatase vollständig dephosphoryliertes IRS-1 nur noch geringfügig durch den Insulinrezeptor phosphoryliert wird[Greene:2002oz]. Nach Behandlung mit Okadeinsäure, einem Inhibitor für Serin- und Threoninphosphatasen, wird in 3T3 Adipocyten und in isolierten Muskelzellen die Insulinweiterleitung gehemmt. Die Insulinrezeptoraktivität bleibt unter diesen Bedingungen unverändert, die IRS-1 abhhängige PI3-Kinaseaktivität und der Glukosetransport sind jedoch vermindert[Jullien:1993bv].

Das Substrat Tyrtide

TyrTide ist ein 85 Aminosäuren umfassendes Fusionsprotein, das mit dem Methionin515 des IRS-1 beginnt und mit einem C-terminalen His-Tag endet. Es hat ein errechnetes Molekulargewicht von 9,2 kDa und enthält drei Tyrosine, von denen jedoch nur eins innerhalb des YMXM-Motiv liegt, das als bevorzugte Phosphorylierungsstelle gilt.

Ziel des Praktikums

Ziel des Praktikums ist es das Substrat Tyrtide mit einem reaktiven Cystein zu versehenen. Hierzu muss es durch PCR aus dem IRS1-Gen zu kloniert, und in den pET-Mod-rCys Vektor ligiert werden. Nach erfolgreicher Klonierung wird das Protein über Nickel-Chelat-Chromatographie gereinigt und phosphoryliert. Anschließend werden Interaktionsversuche zwischen der N-terminalen SH2-Domäne der p85 Untereinheit der pI3-Kinase und dem Substrat Tyrtide durchgeführt. Ziele dieses Praktikums sind das erlernen genereller Klonierungsmethoden, sowie Methoden der Proteinreinigung. Im Laufe des Praktikums soll des weiteren die Herangehensweise an Wissenschaftliche Fragestellung trainiert werden.

Einzelnachweise

↑ Protein-protein interaction in insulin signaling and the molecular mechanisms of insulin resistance Virkamaki, A and Ueki, K and Kahn, CR (1999). J Clin Invest 7 , 931-43
↑ ^a ^b Expression and function of IRS-1 in insulin signal transmission. Sun, X J and Miralpeix, M and Myers, M G Jr and Glasheen, E M and Backer, J M and Kahn, C R and White, M F (1992). J Biol Chem 31 , 22662--22672
↑ Insulin resistance and growth retardation in mice lacking insulin receptor substrate-1 Tamemoto, H and Kadowaki, T and Tobe, K and Yagi, T and Sakura, H and Hayakawa, T and Terauchi, Y and Ueki, K and Kaburagi, Y and Satoh, S (1994). Nature 6502 , 182--186
↑ The Gly972-->Arg amino acid polymorphism in IRS-1 impairs insulin secretion in pancreatic beta cells. Porzio, O and Federici, M and Hribal, M L and Lauro, D and Accili, D and Lauro, R and Borboni, P and Sesti, G (1999). J Clin Invest 3 , 357--364

Durchführung

Tag 1

Durchzuführende Arbeiten:

Ansetzen der PCR
Agarosegel zur Kontrolle der PCR
Restriktionsverdau des PCR-Produkts und des pET-Vektors

Kernfragen:

Was ist der Zweck unserer PCR?
Was macht welche Zutat in der PCR
Warum Primer und warum liegen sie wo sie liegen?
Welche Kontrolle(n) für PCR sind denkbar und wofür werden sie verwendet?
Wie läuft DNA im Agarosegel und warum?
Wie sieht DNA aus (Struktur)?
Welche Restriktionsenzyme verwenden wir und warum?
Was sind die besonderen Eigenschaften des verwendeten Vektors?
Welche Eigenschaften hat jeder Expressionsvektor?
Welche Funktion haben Kinasen?
Was ist bei Ethidiumbromid zu beachten?
Was macht Ethidiumbromid?

PCR

Die Durchführung erfolgt nach dem Protokoll PCR. Als Template für die PCR dient ein Plasmid mit der cDNA für das gesamte humane IRS1 ohne PH-Domäne

Das erwartete PCR-Produkt hat 250 Basenpaare und kodiert für ein Protein von 9 kDa (siehe Abbildung 3).

Primer:

Primer low:

5’-TAT TTC TCG AGG TCT CCA CTG CCC TTT CGG CCA C -3’  (unterstrichen: XhoI Schnittstelle)

Primer up:

5’- TAC ATC ATA TGC CTG CCT ACC CAC CAG GAG GTG G -3’  (unterstrichen: NdeI Schnittstelle)

Eigenleistung: Ansatz für Kontrolle! Was kontrolliert ihr damit? (Protokoll!). Die Pfu-/Taq-Polymerase wird euch von den Assistenten pipettiert. Der ThermoCycler wird stellvertretend von nur einer Gruppe programmiert.

Nach der PCR wird das PCR-Produkt auf ein 2,0 % Agarosegel aufgetragen, um zu überprüfen, ob DNA amplifiziert wurde. Wichtig: Den Ansatz zweimal pipettieren 1x für heute + 1x für Tag 6!!

Ansatz:

 2 µl PCR-Produkt
 1 µl Xylencyanol-Probenpuffer
 7 µl MQ
10 µl Summe

Restriktion

1. PCR-Produkt Es folgt eine doppelte Restriktionshydrolyse des PCR-Produktes mit den Enzymen NdeI und XhoI über Nacht.

46 µl   PCR-Ansatz
  1 µl   NdeI  
  1 µl   XhoI 
  6 µl   Puffer B 
  6 µl   MQ
60µl   Summe

2. pET-Mod-rCys-Vektor Es folgt eine doppelte Restriktionshydrolyse des Ziel-Vektors mit den Enzymen NdeI und XhoI über Nacht.

 2 µl   pET
 1 µl    NdeI
 1 µl    XhoI
 1,5 µl   Puffer B
 9,5 µl   MQ
15 µl   Summe

Verdaut wird bei 37°C über Nacht. Der Vektor-Verdau kann für jeweils zwei Gruppen zusammen angesetzt werden (damit macht also nur jede zweite Gruppe einen Verdau!)

Tag 2

Durchzuführende Arbeiten:

Dephosphorylierung des Vektors
Konzentrationsbestimmung
Ligation
Transformation

Kernfragen:

Was ist im Dephosphorylierungsansatz und warum?
Warum wird Vektor dephosphoryliert?
Warum nur der Vektor?
Warum Inaktivierung und wie?
Warum zwei Gelkonzentrationen?
Wie kontrolliert ihr die Konzentration über das Gel?
Welche Einheit bekommt ihr aus dem Gel und in welche rechnet ihr um?
Warum rechnet man um?
Wie würdet ihr den Ligationsansatz pipettieren?
Was ist im Ligationsansatz und wofür?
Welche Kontrolle(n) braucht ihr für die Ligation?
Was passiert bei der Trafo?
Was habt ihr nach der Trafo in eurem Eppi/Falcon?
Welche Kontrolle(n) braucht ihr für Trafo?
Was ist bei gentechnisch veränderten Organismen zu beachten?

Dephosphorylierung des geschnittenen Vektors:

Ansatz:

15 µl Vektor-Verdau
 1 µl alkalische Phosphatase (shrimp)
 2 µl 10x-Puffer für Phosphatase
 2 µl MQ
20 µl Summe

Inkubation für 15 min bei 37°C
Inkubation für 15 min bei 65 °C zum Inaktivieren

Konzentrationsbestimmung von Vektor und Insert

Vektor und Insert werden auf Agarose-Gele (Insert: 2%; Vektor 0,5%) aufgetragen. Zum bessern Abschätzen der DNA-Menge werden jeweils 1 μl und 2 μl der Probe (+1 μl des entsprechenden (!) Probenpuffers, ad 10 μl mit MQ) sowie ein Massen-Standard mit aufgetragen (s. Anhang).

Ligation

Ligiert werden die geschnittenen PCR-Produkte mit dem geschnittenen pET-Mod-rCys-Vektor. Vorher müsst ihr von ng/μl in fmol/μl [[../Molarität für Dummies|umrechnen]].

Formel:

${\frac {c*10^{-}9}{bp*660}}$

(c[ng/µl]×10-9) / (bp×660[ng/mol]) = c[?/?]

Das Verhältnis von Insert zu Vektor sollte ungefähr 5:1 betragen (fünf Mal mehr Insert als Vektor) und die Stoffmenge der beteiligten Ligationspartner sollte jeweils niemals weniger als 15 fmol im Ligationsansatz betragen.

Ansatz:

 1 µl 10x Ligase Puffer (enthält ATP)
 1 µl T4 Ligase
 x µl Insert
 x µl Vektor
10 µl Summe

Welche Kontrolle wird durchgeführt und wie sieht dieser Ansatz aus (Eigenleistung+Protokoll)?

Inkubation für 3h bei RT

Transformation durch Hitzeschock

Die Transformation erfolgt nach dem Protokoll Transformation von chemisch kompetenten E.coli

Welche Kontrolle(n) werden/wird hier durchgeführt? (Protokoll)

Morgen werden von jeder Gruppe zwei „positive“ Klone (für Mini-Präp/Single Colony-PCR und kleine Expression) und ein Klon von einer „Assistentenplatte“ (für Mini-Präp als Positivkontrolle) gepickt und in einem 15ml Falcon in 5ml LB-Medium + Ampicillin inkubiert (Σ 3 Falcons).

Tag 4

Durchzuführende Arbeiten:

Plasmid-Isolation
Mini-Präp
Restriktionsverdau
Agarosegel
Transformation von E.coli BL21

Kernfragen:

Was macht der TENES-Puffer?
Warum nicht vortexen?
Was macht NaOAc?
Was macht EtOH?
Wo ist nach NaOAc und Zentrifugation die DNA und wo der Dreck?
Wo ist nach EtOH die DNA und wo der Dreck?
Warum ist Trocknen der DNA unverzichtbar?
Warum solltet ihr nach dem Trocken, die DNA doch stark vortexen?
Warum TE+RNAse?
Was untersucht ihr mit der Restriktion?
Wie groß ist das Stück, was herrausfallen sollte?

Mini-Präp

Die Durchführung der Plasmid-Isolation findet nach dem Protokoll Plasmid-DNA-Isolation aus E. coli statt.

Kontroll-Restriktion

Ein Restrikionsverdau zur Kontrolle der Klonierung wird durchgeführt. Geschnitten wird die Plasmid-DNA aus den DNA Präperationen mit NdeI und XhoI. Je Ansatz:

13 µl   DNA 
 1 µl   XhoI 
 1 µl   NdeI
 2 µl   Puffer B
 3 µl   MQ
20 µl  Summe

Inkubation für 2,5h bei 37 °C

Agarosegel

Auf das Gel werden sowohl die Positiv-Kontrolle, als auch euer Klon aufgetragen. Wichtig: Nicht eure DNA vom 1. Tag vergessen!!!

Transformation von E.coli BL21

Die Transformation in die BL21-Zellen findet durch Elektroporation statt. Die Durchführung wird nach dem Protokoll Transformation von elektrokompetenten E.coli durchgeführt

Aliquots von 100 und 300µl werden auf LB-Amp+-Agar ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am Freitag werden von jeder Gruppe zwei Klone gepickt und in 5ml LB-Amp-Medium inkubiert.

Tag 6

Durchzuführende Arbeiten:

Kleine Proteinexpression
SDS-PAGE
Single Colony PCR

Kernfragen:

Diverse Fragen zur DNA Reinigung
Warum messt ihr die OD 600?
Was misst man bei 600nm?
Was ist IPTG?
Warum benutzt man IPTG und nicht Laktose?
Was ist der Unterschied zwischen einer nativen PAGE und einer SDS-PAGE?
Warum haben wir ein Sammel und ein Trenngel?
Was unterscheidet Sammel-und Trenngel?
Welches Gel ist oben, welches unten?
Warum denaturiert man Proteine vor der SDS-PAGE?
Was ist beim Umgang mit Acrylamid zu beachten?

Single Colony PCR Preparation

Es wird mit einer Pipettenspitze etwas Zellsuspension aus BL21 entnommen (eintauchen reicht!), und in 25µl MQ resuspendiert.
Die 25µl Backteriensuspension wird für 2min bei 95°C denaturiert.
Zentriefugieren des Zelldebries für 2min bei max. Geschwindigkeit
Vorsichtig 20µl des Überstandes in ein neues Eppi überführen
Einsetzen von 4µl in den PCR Ansatz
PCR Ansatz und Programm wie oben]

Kleine Protein-Expression

Aus der Übernachtkultur wird im kleinen Maßstab die Proteinexpression induziert, um zu überprüfen ob das Fusionsprotein exprimiert wird. Dieses sollte eine Molmasse von ca.9 kDa haben (Faustregel: 3bp=1AS=110Da). Wichtig: Eine Gruppe des Kurses macht zusätzlich eine Expression eines positiven Klones

Die Durchführung erfolgt analog zum Protokoll kleine Protein Expression

SDS-Proben:

40 µl Zellsuspension
10 µl 5x SDS Probenpuffer

vortexen und runterfugen
5 min im Heizblock bei 95°C (vorher einstellen!) denaturieren
runterzentrifugieren
Jeweils 20µl eurer Proben werden auf das SDS-Gel aufgetragen.

SDS-PAGE

Die Durchführung erfolgt nach dem Protokoll SDS-PAGE. Jeweils 20µl eurer Proben werden auf das SDS-Gel aufgetragen.

Tag 7

Durchzuführende Arbeiten:

Aufreinigung der SH2-Domäne
SDS-PAGE zur Reinigungsdokumentation
Western-Blot
Dialyse des eluierten Proteins

Kernfragen:

Welches Reinigungsprinzip liegt der GSH-Reinigung zu Grunde?
Was ist GST?
Welche besondere Eigenschaft hat GST?
Was ist Gluthation?
Ist das Enzym an der Matrix oder als Tag am Protein?
Warum darf die Matrix nie trocken laufen?
Warum wird mit 1M NaCl (in Tris-Puffer) gewaschen?
Warum wird mit reduziertem Gluthation eluiert?
Was ist das Elutionsprinzip der Reinigung?
Glutathion inhibiert die IGF-Kinase. Welcher Schritt wird im Anschluss vorgenommen um Gluthation zu entfernen?
Warum nicht die Blot-Membran ohne Handschuhe anfassen?
Wieso binden Proteine an die Membran?
Was ist das Prinzip des Blots? Kapilarwirkung?
Warum ist das markieren des Blots so wichtig?
Warum blockt man den Blot ab?

Reinigung der GST-SH2

Die Reinigung erfolg über den GST-Tag am Protein. dazu wird nach dem Protokoll Gluthation Sepharose Reinigung vorgegangen.

Proteinbestimmung

Zur Reinigungsdokumentation wird die Konzentration der Eluate nach Minamide und Bamburg (1990) abgeschätzt. Diese ist von jeder Gruppe einzeln durchzuführen. Die genaue Durchführung erfolgt nach dem Protokoll Spot-Test. Proben, die Protein sichtbar enthalten, werden auf ein SDS-Gel aufgetragen, um die Reinheit des Proteins zu beurteilen.

SDS-Proben:

40 µl von jeder Probe (Proteinlösung, Durchlauf, Waschschritte, ca. 8µg eines Eluates)
10 µl 5x SDS Probenpuffer

vortexen und runterfugen
5 min im Heizblock bei 95°C denaturieren
runterfugen
Jeweils 20µl eurer Proben werden auf ein SDS-Gel aufgetragen.

Western-Blot „Abklatsch“

Der Western Blot erfolgt als Abklatsch, so wie er in der Methode Western Blot unter "Abklatsch" beschrieben ist. Im Anschluss wird der Blot durch 1% BSA in [[../TBS-Puffer|1xTBS-Puffer]] über Nacht abgeblockt. Dabi st darauf zu achten, dass die Seite, auf der das SDS-Gel lag in den Innenraum des Falcons zeigt und GANZ mit Puffer bedeckt ist!

Dialyse der proteinhaltigen Eluate

Es werden nur die Eluate mit hoher Proteinkonzentration vereinigt und dialysiert, vorher mit den Assistenten absprechen!

Dialyseschlauch ( auf Ausschlussgröße achten!!) zuschneiden (ca. 7+(n ml Probenvolumen) cm)
Dialyseschlauch aufkochen (1 min in der Mikrowelle)
Dialyseschlauch an einem Ende zuknoten, mit H2O überprüfen, dass der Knoten auch dicht ist
Probe in den Dialyseschlauch geben
Dialyseschlauch am anderen Ende zuknoten
An jedes Ende des Dialyseschlauch ein Eppi klemmen
Dialyseschlauch in 3L Tris-Puffer 50 mM pH 7,5 legen, auf Rührer stellen

Tag 8

Durchzuführende Arbeiten:

Entwickeln des Western-Blots
Konzentrationsbestimmung der GST-SH2
Aufreinigung von Tyrtide-rCys
SDS-PAGE zur Reinigungsdokumentation
Dialyse der proteinhaltigen Eluate

Kernfragen:

Warum ist es wichtig, dass die Seite des Blots auf der das Gel lag nach innen zeigt?
Wie sieht ein AK aus?
Was macht Papain + Pepsin?
Welche Antikörper gibt es? Wann benutzt man welchen?
Warum benutzen wir zwei Antikörper?
Gegen was ist der erste, gegen was der zweite AK?
Wie funktioniert die Farbreaktion bei der alkalischen Phosphatase?
Warum den Blot beim Entwickeln nicht schwenken?
Warum muss man gut waschen (Ostwaldsche Verdünnungsgesetz)?
Warum mit Essigsäure abstoppen?
Woran erkennt ihr Unspezifität?
Liegt die Unspezifität am ersten oder zweiten AK?
Warum muss der Blot dunkel gelagert werden?
Was ist das Prinzip dieser Reinigung?
Warum wird mit einem imidazolhaltigen Puffer gewaschen?

Entwickeln des Western-Blots mittels Antikörpers

Blot in ein 15ml Falcon überführen

- Hierbei ist darauf zu achten, dass die Seite auf der Gel lag nach innen zeigt

5x5min mit TBS/Tween waschen
Inkubation für 1h bei RT mit 2ml 1.AK (α-GST rabbit 1:3000)
5x5min mit TBS/Tween waschen
Inkubation für 1h bei RT mit 2ml 2.AK (α-rabbit AP 1:2000)
5x5min mit TBS/Tween waschen
Blot nicht trocken lassen!

Zum Blotentwickeln wird eine NBT/Bcip-Tablette in 10ml MQ gelöst (am Besten in einer Edelstahlschale oder 200ml Becherglas).
Blot ganz mit Entwickler überdecken und dann ruhen lassen!
Die Färbung sollte innerhalb von ca. 2min geschehen, danach wird es unspezifisch!
Zeigen sich Banden, den Blot SOFORT mit 10%iger Essigsäure abstoppen.
Der Blot wird nun unter Lichtausschluß getrocknet und dann in Alufolie aufbewahrt.

Nickel-Chelatreinigung von Tyrtide-rCys

Die Durchführung erfolgt nach dem Protokoll Nickel-Chelatreinigung.

Protein-Konzentrationsbestimmung

Die Konzentration der nun dialysierten Eluate aus der GSH-Reinigung wird durch einen Spot-Test bestimmt. Das Protokoll ist hier zu finden Konzentrationsbestimmung von Proteinen

[Virkamaki,_A_and_Ueki,_K_and_Kahn,_CR-1] Protein-protein interaction in insulin signaling and the molecular mechanisms of insulin resistance Virkamaki, A and Ueki, K and Kahn, CR (1999). J Clin Invest 7 , 931-43

[Sun,_X_J_and_Miralpeix,_M_and_Myers,_M_G_Jr_and_Glasheen,_E_M_and_Backer,_J_M_and_Kahn,_C_R_and_White,_M_F-2] Expression and function of IRS-1 in insulin signal transmission. Sun, X J and Miralpeix, M and Myers, M G Jr and Glasheen, E M and Backer, J M and Kahn, C R and White, M F (1992). J Biol Chem 31 , 22662--22672

[Tamemoto,_H_and_Kadowaki,_T_and_Tobe,_K_and_Yagi,_T_and_Sakura,_H_and_Hayakawa,_T_and_Terauchi,_Y_and_Ueki,_K_and_Kaburagi,_Y_and_Satoh,_S-3] Insulin resistance and growth retardation in mice lacking insulin receptor substrate-1 Tamemoto, H and Kadowaki, T and Tobe, K and Yagi, T and Sakura, H and Hayakawa, T and Terauchi, Y and Ueki, K and Kaburagi, Y and Satoh, S (1994). Nature 6502 , 182--186

[Porzio,_O_and_Federici,_M_and_Hribal,_M_L_and_Lauro,_D_and_Accili,_D_and_Lauro,_R_and_Borboni,_P_and_Sesti,_G-4] The Gly972-->Arg amino acid polymorphism in IRS-1 impairs insulin secretion in pancreatic beta cells. Porzio, O and Federici, M and Hribal, M L and Lauro, D and Accili, D and Lauro, R and Borboni, P and Sesti, G (1999). J Clin Invest 3 , 357--364

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