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Institut:Biochemie/Klonieren für Ungeduldige

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Von der Idee zum Protein in nur 5 Tagen[Bearbeiten]

Das geht natürlich nur, wenn sich das Protein auch in E. coli DH5a exprimieren lässt und die Primer in der Arbeitsgruppe schon vorliegen. Ich schreibe hier mal den Weg in Stichpunkten mit der jeweiligen Verlinkung zum Protokoll auf.

Vorbereitung[Bearbeiten]

  • Primer designen und bestellen
  • LB-Medium, Agar-Platten, kompetente Bakterien vorbereiten

Durchführung[Bearbeiten]

  • PCR
    • irgendwo muss das Wunsch-Insert ja herkommen
  • Restriktion von Vektor und Insert
    • damit auch alles schön zusammen passt
  • Dephosphorylierung des Vektors
    • damit dieser nicht reliegiert
  • DpnI verdau des PCR-Produktes
  • Vektor und Insert reinigen
  • Konzentrationsbestimmung von Vektor und Insert
  • Ligation
  • Transformation
  • kleine Protein Expression
    • das geht nur, wenn sich das Protein schon in Dh5a Zellen expremieren lässt. Sonst muss noch in BL21-DE3 oder andere Zelltypen umkloniert werden