Institut:Biochemie/Klonieren für Ungeduldige

Von der Idee zum Protein in nur 5 Tagen

Das geht natürlich nur, wenn sich das Protein auch in E. coli DH5a exprimieren lässt und die Primer in der Arbeitsgruppe schon vorliegen. Ich schreibe hier mal den Weg in Stichpunkten mit der jeweiligen Verlinkung zum Protokoll auf.

Vorbereitung

Primer designen und bestellen
LB-Medium, Agar-Platten, kompetente Bakterien vorbereiten

Durchführung

PCR
- irgendwo muss das Wunsch-Insert ja herkommen
Restriktion von Vektor und Insert
- damit auch alles schön zusammen passt
Dephosphorylierung des Vektors
- damit dieser nicht reliegiert
DpnI verdau des PCR-Produktes
- Parentale, methylierte Plasmid-DNA (Template) mit dem Restriktionsenzym DpnI, welches nur dam methylierte DNA spaltet, abgebaut. Somit bleibt nur noch das PCR-Produkt übrig
Vektor und Insert reinigen
Konzentrationsbestimmung von Vektor und Insert
Ligation
Transformation
kleine Protein Expression
- das geht nur, wenn sich das Protein schon in Dh5a Zellen expremieren lässt. Sonst muss noch in BL21-DE3 oder andere Zelltypen umkloniert werden