HPLC

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High Performance Liquid Chromatography

Methode

Einschalten

1. Kontrollgerät einschalten
2. Pumpen A und B einschalten
3. Photometer einschalten und auf "AUTO" drücken
4. Drucker: Auf "# %/INJ A" drücken
5. Probensammler einschalten

Vorbereiten

1. Schlauch von Pumpe A in Puffer A hängen, mit Parafilm abdichten
2. Schlauch von Pumpe B in Puffer B hängen, mit Parafilm abdichten
3. C.FLOW auf 5 stellen
4. Pumpe A reinigen
   1. B.CONC auf 0% stellen
   2. Rad an Pumpe A aufdrehen
   3. START drücken
   4. nach 2-3 min auf STOP drücken
   5. Rad an Pumpe A zudrehen
5. Pumpe B reinigen
   1. B.CONC auf 100% stellen
   2. Rad an Pumpe B aufdrehen
   3. START drücken
   4. nach 2-3 min auf STOP drücken
   5. Rad an Pumpe B zudrehen
6. T.FLOW auf 1 stellen
7. B.CONC auf 0% stellen
8. START drücken
9. 20 Minuten warten

Probe vorbereiten

1. Probe ggfs. mit TRIS (50 mM pH 7.5) auf nennenswertes Volumen (z.B. 20µl) auffüllen
2. Mit 1% TFA auf 0,1% TFA Endkonzentration einstellen
3. 100 µl 0,1% TFA dazugeben
4. In Tischzentrifuge (14.000 rpm, 4 min)
5. Überstand wird injiziert (siehe unten)

Lauf starten

1. T.FLOW auf 0.5 stellen
2. START drücken
3. Am Photometer AUTO drücken
4. Injektor auf LOAD stellen
5. Probe auftragen
6. Injector auf INJECT stellen
7. Nach 2-3 Minuten Injektor auf LOAD stellen
8. Wenn Peak erscheint (Drucker oder Photometer), Probensammler aktivieren

Lauf beenden

Die Säule kann für kurze Zeiträume (Tage oder Wochen) in 0,1% TFA gelagert werden. Für längere Zeiträume sollte sie in Methanol gelagert werden:

1. Die Schläuche aus Puffer A und B mit MQ abspülen, in Methanol hängen
2. T.FLOW für 10 Minuten auf 1 stellen
3. Jede Pumpe je 1 Minute durchspülen (Rad)
4. Probensammler, Pumpen, Kontrollgerät, Photometer abschalten

Proben waschen

Proben werden in der SpeedVac (die linke, "Saure Hydrolyse") getrocknet (lysophilisiert). Proben können in trockenem Zustand bei -20°C gelagert werden.

1. Proben trocknen
2. 3× je 30 µl 0,05% Ammoniumhydroxid dazugeben, erneut trocknen
3. 3× je 50 µl MQ dazugeben, erneut trocknen
4. In 50 mM TRIS/HCl (pH 7.5 oder 8.0) aufnehmen

Materialien

HPLC-Puffer

• MQ entgasen
• 10% und 1% TFA-(TriFluorEssigsäure)-Stammlösungen ansetzen
• Puffer A : 0,1% TFA in MQ (ca. 150 ml pro Lauf)
• Puffer B : 0,1% TFA und 80% Acetonitril (CH₃CN) in MQ (ca. 100 ml pro Lauf)

Waschlösung

• Ammoniumhydroxid (NH₄OH) = Ammoniak-Wasser (NH₃*H₂O)
• 0,05% entspricht 2 µl 25%iges Ammoniumhydroxid in 1 ml MQ

Programm

Beispiel :

 0.1  T.FLOW 0.5
 0.1  B.CONC 0
 0.25 B.CONC 0
10    B.CONC 30
60    B.CONC 80
60.1  B.CONC 100
65    B.CONC 100
70    B.CONC 0
90    B.CONC 0
90.1  STOP
      END

Integrator einrichten

z.B. nach Stromausfall

• Datum & Uhrzeit eingeben (Werte egal)
• Peak width : SHIFT SHIFT P W SHIFT = 6
• Minimum areas : SHIFT SHIFT M A SHIFT = 5 0 0 0 0 0 0
• Chart speed : SHIFT SHIFT C S SHIFT = . 1
• Attenuation : SHIFT SHIFT A T SHIFT = 5 1 2
• Background correction : PT EVAL (bei stabilem Photometerwert; dauert ca. 60 Sekunden, gibt dann einen Wert aus)