HPLC

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High Performance Liquid Chromatography

Methode[Bearbeiten]

Einschalten[Bearbeiten]

  1. Kontrollgerät einschalten
  2. Pumpen A und B einschalten
  3. Photometer einschalten und auf "AUTO" drücken
  4. Drucker: Auf "# %/INJ A" drücken
  5. Probensammler einschalten

Vorbereiten[Bearbeiten]

  1. Schlauch von Pumpe A in Puffer A hängen, mit Parafilm abdichten
  2. Schlauch von Pumpe B in Puffer B hängen, mit Parafilm abdichten
  3. C.FLOW auf 5 stellen
  4. Pumpe A reinigen
    1. B.CONC auf 0% stellen
    2. Rad an Pumpe A aufdrehen
    3. START drücken
    4. nach 2-3 min auf STOP drücken
    5. Rad an Pumpe A zudrehen
  5. Pumpe B reinigen
    1. B.CONC auf 100% stellen
    2. Rad an Pumpe B aufdrehen
    3. START drücken
    4. nach 2-3 min auf STOP drücken
    5. Rad an Pumpe B zudrehen
  6. T.FLOW auf 1 stellen
  7. B.CONC auf 0% stellen
  8. START drücken
  9. 20 Minuten warten

Probe vorbereiten[Bearbeiten]

  1. Probe ggfs. mit TRIS (50 mM pH 7.5) auf nennenswertes Volumen (z.B. 20µl) auffüllen
  2. Mit 1% TFA auf 0,1% TFA Endkonzentration einstellen
  3. 100 µl 0,1% TFA dazugeben
  4. In Tischzentrifuge (14.000 rpm, 4 min)
  5. Überstand wird injiziert (siehe unten)

Lauf starten[Bearbeiten]

  1. T.FLOW auf 0.5 stellen
  2. START drücken
  3. Am Photometer AUTO drücken
  4. Injektor auf LOAD stellen
  5. Probe auftragen
  6. Injector auf INJECT stellen
  7. Nach 2-3 Minuten Injektor auf LOAD stellen
  8. Wenn Peak erscheint (Drucker oder Photometer), Probensammler aktivieren

Lauf beenden[Bearbeiten]

Die Säule kann für kurze Zeiträume (Tage oder Wochen) in 0,1% TFA gelagert werden. Für längere Zeiträume sollte sie in Methanol gelagert werden:

  1. Die Schläuche aus Puffer A und B mit MQ abspülen, in Methanol hängen
  2. T.FLOW für 10 Minuten auf 1 stellen
  3. Jede Pumpe je 1 Minute durchspülen (Rad)
  4. Probensammler, Pumpen, Kontrollgerät, Photometer abschalten

Proben waschen[Bearbeiten]

Proben werden in der SpeedVac (die linke, "Saure Hydrolyse") getrocknet (lysophilisiert). Proben können in trockenem Zustand bei -20°C gelagert werden.

  1. Proben trocknen
  2. 3× je 30 µl 0,05% Ammoniumhydroxid dazugeben, erneut trocknen
  3. 3× je 50 µl MQ dazugeben, erneut trocknen
  4. In 50 mM TRIS/HCl (pH 7.5 oder 8.0) aufnehmen

Materialien[Bearbeiten]

HPLC-Puffer[Bearbeiten]

  • MQ entgasen
  • 10% und 1% TFA-(TriFluorEssigsäure)-Stammlösungen ansetzen
  • Puffer A : 0,1% TFA in MQ (ca. 150 ml pro Lauf)
  • Puffer B : 0,1% TFA und 80% Acetonitril (CH3CN) in MQ (ca. 100 ml pro Lauf)

Waschlösung[Bearbeiten]

  • Ammoniumhydroxid (NH4OH) = Ammoniak-Wasser (NH3*H2O)
  • 0,05% entspricht 2 µl 25%iges Ammoniumhydroxid in 1 ml MQ

Programm[Bearbeiten]

Beispiel :

 0.1  T.FLOW 0.5
 0.1  B.CONC 0
 0.25 B.CONC 0
10    B.CONC 30
60    B.CONC 80
60.1  B.CONC 100
65    B.CONC 100
70    B.CONC 0
90    B.CONC 0
90.1  STOP
      END

Integrator einrichten[Bearbeiten]

z.B. nach Stromausfall

  • Datum & Uhrzeit eingeben (Werte egal)
  • Peak width : SHIFT SHIFT P W SHIFT = 6
  • Minimum areas : SHIFT SHIFT M A SHIFT = 5 0 0 0 0 0 0
  • Chart speed : SHIFT SHIFT C S SHIFT = . 1
  • Attenuation : SHIFT SHIFT A T SHIFT = 5 1 2
  • Background correction : PT EVAL (bei stabilem Photometerwert; dauert ca. 60 Sekunden, gibt dann einen Wert aus)