Institut:Biochemie/Gluthation Sepharose Reinigung

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Methode

Herstellung der Säule

1. Leere Säule (geeignet: benutzte NucleoBond-Säule) und Teflon-Einlage mit MQ und Ethanol spülen
2. Doppeltes Zielvolumen der Säule an Glutathion-Sepharose einfüllen (im Kühlraum)
3. PBS-Puffer frisch ansetzen
4. Mit 20× Säulenvolumen PBS spülen
5. Auslauf schließen, etwas PBS stehen lassen (Säule darf nie trocken laufen!)

Proteinreinigung

1. Säule mit 3× Säulenvolumen an PBS äquilibrieren
2. Proteinlösung (z.B. Überstand einer Zentrifugation) auf die Säule geben, je 50 µl von Überstand und Durchlauf in Eppis auffangen
3. Für Proteine aus E. coli (zur ATPase-Entfernung) :
   • Mit 5-10× Säulenvolumen PBS waschen
   • Bei Raumtemperatur mit 10× Säulenvolumen ATPase-Entfernungs-Puffer waschen
4. Säule mit 5-10× Säulenvolumen 1M NaCl (in 50 mM Tris, pH 7,5) waschen, 50 µl Durchlauf in Eppi auffangen
5. Säule mit 5-10× Säulenvolumen an PBS waschen, 50 µl Durchlauf in Eppi auffangen
6. Säule 4× mit 2× Säulenvolumen Elutionspuffer eluieren
7. Säule 3× abwechselnd mit je 15 ml Regenerationspuffer 1 und Regenerationspuffer 2 regenerieren
8. Säule in 20% Ethanol lagern
9. Eluate bei -80°C einfrieren
10. Eingeengtes Protein in 50 µl Aliquots in 0,5 ml Eppis füllen, in flüssigem Stickstoff schockgefrieren, bei -80°C lagern

Materialien

• Säule mit Tefloneinlage (z.B. NucleoBond-Säule), PBS-Puffer
• 3 kleine, 5 2ml Eppis
• Glutathion-Sepharose-Regenerationspuffer I (0.5 l)
  • Tris (M_W=121.14) : 6.06 g (Endkonzentration 0.1M)
  • NaCl (M_W=58.44) : 14.61 g (Endkonzentration 0.5M)
  • Mit HCl auf pH 8.5 einstellen, filtrieren
• Glutathion-Sepharose-Regenerationspuffer II (0.5 l)
  • Na-Acetat (M_W=82.03) : 4.1 g (Endkonzentration 0.1M)
  • NaCl (M_W=58.44) : 14.61 g (Endkonzentration 0.5M)
  • Mit Essigsäure auf pH 4.5 einstellen, filtrieren
• Glutathion-Sepharose-Elutionspuffer
  • Tris-HCl 50 mM pH 8.5 (0.121g in 20 ml bzw. 0.182g in 30 ml MQ lösen)
  • direkt vor Gebrauch reduziertes L-Glutathion hinzugeben (0.0615g in 20 ml bzw. 0.09219g in 30 ml) → Endkonzentration 10 mM mit pH ~8.0

	Elutionspuffer (20 ml)	Regenerationspuffer 1 (0,5 l)	Regenerationspuffer 2 (0,5 l)
Tris (MW=121.14)	0,121 g (EK 50 mM)	6,06 g (EK 0,1 M)
NaCl (MW=58.44)		14,61 g (EK 0,5 M)	14,61 g (EK 0,5 M)
Na-Acetat (MW=82.03)			4,1 g (EK 0,1M)
L-Glutathion (reduziert)	0.0615 g (EK 10 mM)
einstellen auf pH	s. Beschreibung im Text	8.5	4.5
mit		HCl	Essigsäure

ATPase-Entfernungs-Puffer

Erst direkt vor Gebrauch ansetzen!

• 0,076g (→2,5mM) ATP (nicht das teure verwenden!)
• 0,1012g (→10mM) MgCl₂
• In 50 ml 50mM TRIS lösen
• Auf pH 7.5 einstellen