Institut:Biochemie/Konzentrationsbestimmung von Proteinen
Bradford (für 2 bis 8 µg Protein)
[Bearbeiten]Die Proteinkonzentration wird bei dieser Methode photometrisch bei einer Analysenwellenlänge von λ=595 nm gemessen. Dazu werden 100 µl der Proteinlösung unbekannter Konzentration und jeweils 100 µl von BSA-Eichlösungen (10-3 bis 5*10-2 µg/µl) mit jeweils 100 µl Bradford-Färbereagenz in einer Mikrotiterplatte für 5 min. bei RT inkubiert. Anschließend wird in einem "Microplate Reader" die Absorption des Komplexes aus Protein und Färbereagenz bestimmt. Mithilfe der BSA-Eichgrade kann die Konzentration der zu analysierenden Proteinprobe ermittelt werden.
Bradford-Färbelösung
[Bearbeiten]in MQ | Endkonzentration | 100 ml |
---|---|---|
Coomassie Brilliant Blue G250/ Serva Blue G |
0,06% | 60 mg |
Perchlorsäure (HClO4), 70% | 1,9% | 2,7 ml |
lichtgeschützt aufbewahren |
Bradford-Färbelösung, Variante für kleine Proteinmengen (0,1-1,0 µg/µl)
[Bearbeiten]Verwendung: Protein in 10µL MQ vorlegen und mit 250µL Bradfordreagenz auffüllen. 15' bei RT stehen lassen und photometrisch bei λ=595 nm analysieren.
TIPP: Coomassie zunächst in EtOH lösen, da in MQ nur schlecht löslich.
Mikrotiterplatte verwenden! ->Spart die große Höllenarbeit und Küvettenschieberei.
Protokoll nach Yelena Sofina added 28-Aug-2005 Alexander Krupp |
in MQ | Endkonzentration | 500 ml |
---|---|---|
Coomassie Brilliant Blue G250/ Serva Blue G |
0,004% | 20 mg |
EtOH(96%) | ~5,0% (v/v) | 25 ml |
Phosphorsäure (H3PO4), 85%(v/v) | 8,5% | 50 ml |
lichtgeschützt bei 4°C aufbewahren |
SPOT-Test
[Bearbeiten]- Für die 12 BSA-Standards und die aufzutragenden Proben werden je zwei Felder (1x1 cm) mit Bleistift auf Munktell-Filterpapier gezeichnet (Papier nur mit Handschuhen und nur an den Ecken anfassen!).
- In die Mitte jedes Feldes wird 1 µl Standard bzw. Probe aufgetragen.
- Wenn die Standards in aufsteigender Reihenfolge aufgetragen werden, kann die selbe Pipettenspitze verwendet werden.
- Kurz eintrocknen lassen.
- Das Papier wird kurz in die Färbelösung getaucht.
- Das Papier wird in Entfärbelösung auf einen Schüttler gelegt. Wenn die Entfärbelösung blau wird, muss sie durch frische ersetzt werden.
Lösungen
[Bearbeiten]Für 500 ml | Färbelösung | Entfärbelösung |
---|---|---|
Methanol (technisches) | 50 ml | 50 ml |
Essigsäure | 35 ml | 35 ml |
0,25% Coomassie Brilliant Blue G250 oder Serva Blue G |
1,25 g |
BSA-Standards
[Bearbeiten]500 µl Aliquots : 7,5 mg BSA mit MQ auf 1,5 ml auffüllen
µl Mischung | µl MQ | Endkonzentration (µg/µl) |
---|---|---|
500 | 0 | 5,0 |
200 | 300 | 2,0 |
100 | 400 | 1,0 |
90 | 410 | 0,9 |
80 | 420 | 0,8 |
70 | 430 | 0,7 |
60 | 440 | 0,6 |
50 | 450 | 0,5 |
40 | 460 | 0,4 |
30 | 470 | 0,3 |
20 | 480 | 0,2 |
10 | 490 | 0,1 |