Institut:Biochemie/PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) zum Amplifizieren von DNA-Fragmenten.

Methode

Die zu amplifizierende DNA wird in mehreren Zyklen kopiert, wobei die Zahl der Kopien exponentiell ansteigt. Die Anzahl der Zyklen beträgt in der Regel 20-50, und wird der erwarteten Genauigkeit der Amplifikation angepasst. Jeder der Zyklen besteht prinzipiell aus folgenden Schritten:

Denaturierung der Matrizen-DNA bei 95°C
Hybridisierung (Annealing) der Oligonikleotidprimer an die Enden der Zielsequenz (Temperatur ist abhängig vom Schmelzpunkt der Primer T_m). Je höher die Temperatur, desto spezifischer ist die Hybridisierung
Elongation durch eine hitzestabile DNA-Polymerase bei 72°C (~2 min/1000 Basenpaare)

Standardansatz (50 µl)

 5    µl 10× Pfu Puffer
 1    µl PCR-Nukleotidmix (dNTP)
 1    µl 100 ng/µl Matrizen-DNA (Template); bei Kontrollansatz 1 µl MQ
 1,25 µl 100 ng/µl Primer up
 1,25 µl 100 ng/µl Primer low
 1    µl Pfu-Polymerase
39,5  µl MQ

Standardprogramm

#	Min	Sec	°C	Vorgang	Zyklen
1.	0	45+	96	Hotstart
Jetzt Polymerase dazugeben
2.	0	45	96	Denaturieren	20-30×
3.	0	45	55+	Annealing
4.	0	30+	72	Elongation
5.	10	0	72	Last extension
6.	∞		4	Hold

Merksätze

Gelieferte Primer zu 1 µg/µl in MQ lösen.
Fremde Templates durch Restriktionsenzymspaltung oder Sequenzierung auf Korrektheit überprüfen!
Hast Du keine Primer mehr, fällt die PCR Dir schwer.