Institut:Biochemie/PCR

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Polymerase Chain Reaction (PCR) zum Amplifizieren von DNA-Fragmenten.

Methode[Bearbeiten]

Die zu amplifizierende DNA wird in mehreren Zyklen kopiert, wobei die Zahl der Kopien expotentiell ansteigt. Die Anzahl der Zyklen beträgt in der Regel 20-50, und wird der erwarteten Genauigkeit der Amplifikation angepasst. Jeder der Zyklen besteht prinzipiell aus folgenden Schritten:

  1. Denaturierung der Matrizen-DNA bei 95°C
  2. Hybridisierung (Annealing) der Oligonikleotidprimer an die Enden der Zielsequenz (Temperatur ist abhängig vom Schmelzpunkt der Primer Tm). Je höher die Temperatur, desto spezifischer ist die Hybridisierung
  3. Elongation durch eine hitzestabile DNA-Polymerase bei 72°C (~2 min/1000 Basenpaare)

Standardansatz (50 µl)[Bearbeiten]

 5    µl 10× Pfu Puffer
 1    µl PCR-Nukleotidmix (dNTP)
 1    µl 100 ng/µl Matrizen-DNA (Template); bei Kontrollansatz 1 µl MQ
 1,25 µl 100 ng/µl Primer up
 1,25 µl 100 ng/µl Primer low
 1    µl Pfu-Polymerase
39,5  µl MQ

Standardprogramm[Bearbeiten]

# Min Sec °C Vorgang Zyklen
1. 0 45+ 96 Hotstart
Jetzt Polymerase dazugeben
2. 0 45 96 Denaturieren 20-30×
3. 0 45 55+ Annealing
4. 0 30+ 72 Elongation
5. 10 0 72 Last extension
6. 4 Hold

Merksätze[Bearbeiten]

  • Gelieferte Primer zu 1 µg/µl in MQ lösen.
  • Fremde Templates durch Restriktionsenzymspaltung oder Sequenzierung auf Korrektheit überprüfen!
  • Hast Du keine Primer mehr, fällt die PCR Dir schwer.