Institut:Biochemie/Restriktionshydrolyse

Aus Wikiversity
Zur Navigation springen Zur Suche springen

Methode[Bearbeiten]

Am Beispiel eines Doppelverdaus mit BamHI und EcoRI in Puffer "B" (blau).

PCR[Bearbeiten]

Ausgehend von 50 µl Ansatz.

  • ganzer PCR-Ansatz
  • 0,5 µl BamHI
  • 0,5 µl EcoRI (erst später dazugeben, aber schon einrechnen)
  • 6 µl Puffer "B"
  • mit MQ auf 60 µl auffüllen

Plasmid[Bearbeiten]

Ausgehend von 5 µl Volumen. Faustregel: Pro 1 µg DNA ist ein Reaktionsvolumen von 20 µl zu wählen. Wieviel units Enzym man zum verdauen braucht, ergibt sich aus der eingesetzten Menge DNA.

  • 5 µl Plasmid
  • 1 µl BamHI
  • 1 µl EcoRI (erst später dazugeben, aber schon einrechnen)
  • 6 µl Puffer "B"
  • mit MQ auf 60 µl auffüllen

Reaktionszeiten[Bearbeiten]

BamHI nach Puffer und MQ hinzugeben. Kurz anzentrifugieren. Für 1 Stundenbei 37°C im Wasserbad stehen lassen. Danach EcoRI dazugeben und wiederum für 1 Stunde im Wasserbad stehen lassen. Alternativ beide Restriktionsenzyme am Anfang dazugeben und über Nacht stehen lassen.

Materialien[Bearbeiten]

Restriktionsenzyme, Puffer, MQ, 37°C Bad