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Institut:Biochemie/Restriktionshydrolyse

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Methode

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Am Beispiel eines Doppelverdaus mit BamHI und EcoRI in Puffer "B" (blau).

Ausgehend von 50 µl Ansatz.

  • ganzer PCR-Ansatz
  • 0,5 µl BamHI
  • 0,5 µl EcoRI (erst später dazugeben, aber schon einrechnen)
  • 6 µl Puffer "B"
  • mit MQ auf 60 µl auffüllen

Plasmid

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Ausgehend von 5 µl Volumen. Faustregel: Pro 1 µg DNA ist ein Reaktionsvolumen von 20 µl zu wählen. Wieviel units Enzym man zum verdauen braucht, ergibt sich aus der eingesetzten Menge DNA.

  • 5 µl Plasmid
  • 1 µl BamHI
  • 1 µl EcoRI (erst später dazugeben, aber schon einrechnen)
  • 6 µl Puffer "B"
  • mit MQ auf 60 µl auffüllen

Reaktionszeiten

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BamHI nach Puffer und MQ hinzugeben. Kurz anzentrifugieren. Für 1 Stundenbei 37°C im Wasserbad stehen lassen. Danach EcoRI dazugeben und wiederum für 1 Stunde im Wasserbad stehen lassen. Alternativ beide Restriktionsenzyme am Anfang dazugeben und über Nacht stehen lassen.

Materialien

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Restriktionsenzyme, Puffer, MQ, 37°C Bad