Institut:Biochemie/Restriktionshydrolyse

Methode

Am Beispiel eines Doppelverdaus mit BamHI und EcoRI in Puffer "B" (blau).

PCR

Ausgehend von 50 µl Ansatz.

ganzer PCR-Ansatz
0,5 µl BamHI
0,5 µl EcoRI (erst später dazugeben, aber schon einrechnen)
6 µl Puffer "B"
mit MQ auf 60 µl auffüllen

Plasmid

Ausgehend von 5 µl Volumen. Faustregel: Pro 1 µg DNA ist ein Reaktionsvolumen von 20 µl zu wählen. Wieviel units Enzym man zum verdauen braucht, ergibt sich aus der eingesetzten Menge DNA.

5 µl Plasmid
1 µl BamHI
1 µl EcoRI (erst später dazugeben, aber schon einrechnen)
6 µl Puffer "B"
mit MQ auf 60 µl auffüllen

Reaktionszeiten

BamHI nach Puffer und MQ hinzugeben. Kurz anzentrifugieren. Für 1 Stundenbei 37°C im Wasserbad stehen lassen. Danach EcoRI dazugeben und wiederum für 1 Stunde im Wasserbad stehen lassen. Alternativ beide Restriktionsenzyme am Anfang dazugeben und über Nacht stehen lassen.

Materialien

Restriktionsenzyme, Puffer, MQ, 37°C Bad