Institut:Biochemie/Transformation von elektrokompetenten E.coli

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Methode[Bearbeiten]

Vorbereitung[Bearbeiten]

Die in den Transformationsansatz eingehende Flüssigkeit muss möglichst salzfrei sein. Dazu kann z.B. ein Ligationsansatz gegen 10% Glycerol auf einem Nitrozellulosefilter dialysiert werden.

  1. Pro Ansatz 20 ml 10%ige Glycerol-(MQ-)Lösung herstellen und in je ein Becherglas geben.
  2. Pro Ansatz einen Nitrocellulosefilter von den blauen Schutzfolien befreien (den Filter nur mit Pincette berühren, nicht mit den Händen!).
  3. Den Nitrocellulosefilter auf die Glycerol-Lösung legen.
  4. Den Ansatz auf den Nitrocellulosefilter pipettieren.
  5. Nach 1 Stunde kann der salzfreie Ansatz von Filter abpipettiert werden.

Transformation[Bearbeiten]

  1. 10-100 ng (dialysiert bei Bedarf) Plasmid in 50 µl MQ geben.
  2. Kurz auf Eis stellen.
  3. 30 µl elektrokompetente Bakterien dazugeben (ein Eppi mit EK-Bakterien enthält ca. 60 µl).
  4. Als Negativkontrolle 30 µl elektrokompetente Bakterien in 50 µl MQ (ohne Plasmid) geben.
  5. Beides in je eine auf Eis gekühlte Küvette geben.
  6. Bei 1.700 V transformieren (die time constant sollte größer als 4.0 sein).
  7. 1ml 37°C warmes LB-Medium (ohne Ampicillin) in Küvetten geben, mischen.
  8. Flüssigkeit in 15 ml Falcon überführen, 1h bei 37°C schütteln lassen (180 oder 220 rpm).
  9. Küvetten ausspülen (max. 1h in Helipur-Sterillösung 6%, danach mit H2O und EtOH waschen und über Nacht in EtOH stehen lassen).
  10. Bakterien 1:10 mit LB+Amp-Medium verdünnen, 100µl bzw. 20µl auf LB-Amp-Platten ausstreichen.