Midi-Prep
Die Midi-Prep zur Gewinnung von Plasmid-DNA aus E. coli
Methode
[Bearbeiten]Anzucht der Bakterienkultur
[Bearbeiten]- Kolonie von Platte picken und in in 3-5 ml LB+AMP geben (in 15 ml Falcons; Übertag-Kultur)
- Beispiel: 1:250 animpfen! 120 µl in 30 ml LB+AMP geben (in 50 ml Erlenmeyer-Kolben; Übernacht-Kultur)
- Bei Bedarf OD600 im Photometer bestimmen
Durchführung der Midi-Prep
[Bearbeiten]Die große Zentrifuge mit 22.50-Rotor auf 4°C bringen, je Midi-Prep ein Zentrifugenröhrchen (lila Deckel) auf Eis stellen. Für Plasmide mit geringer Ausbeute den "low-copy"-Modus verwenden.
- Die Übernachtkultur in 50 ml Falcon-Tubes überführen
- bei 3500 g für 15 min. bei 4°C in der Zentrifuge in der Gentechnik pelletieren
- Überstand verwerfen
- resuspendieren in 4 ml (low-copy:8 ml) Puffer S1+RNAse auf Eis
- hinzufügen von 4 ml (low-copy:8 ml) Puffer S2
- in vorgekühlte Zentrifugenröhrchen (lila Deckel) überführen
- mehrmals invertieren, nicht vortexen!
- maximal 5 min. bei Raumtemperatur stehen lassen
- hinzufügen von 4 ml (low-copy:8 ml) Puffer S3
- mehrmals invertieren, nicht vortexen!
- für 5 min auf Eis stehen lassen
- bei bei Benutzung der SS34-Röhrchen und dazugehörigem Rotor: 15.000g 4°C für 25 min. zentrifugieren
Die Pause kann genutzt werden, um die Tischzentrifuge einzuschalten und auf 4°C zu bringen und die Säule mit 2,5 ml Puffer N2 zu äquilibrieren!
- Überstand durch Papierfilter auf Säule geben
- Durchlauf nochmals auf Säule geben, um Ausbeute zu erhöhen
- Säule mit 2x mit 5 ml Puffer N3 waschen, Durchlauf verwerfen
- Säule mit 5x 1 ml Puffer N5 (auf 50°C vorgewärmt, funktioniert auch bei Zimmertemperatur!!!) eluieren, in 2ml-Eppis auffangen
- zu jedem Eppi 0,8 ml Isopropanol hinzufügen, 5 mal invertieren
- zentrifugieren bei 4°C für 30 min. in der Tischzentrifuge bei 20.000g
Die Pause kann genutzt werden, um 70% EtOH und TE-Puffer bzw. MQ auf Eis zu stellen!
- Überstand verwerfen (abpipettieren!)
- waschen mit kaltem 1,4 ml 70% EtOH
- zentrifugieren bei 15.000g bei 4°C für 10 min.
Die Pause kann genutzt werden, um einen Kaffee zu trinken!
- Überstand verwerfen (abpipettieren!)
- trocknen (bei Raumtemperatur für 10 min oder bei 37°C für 5 min)
- Aufnehmen in kalten TE-Puffer oder MQ (bei Sequenzierung!) (entweder jedes Eppi in 50 µl, 20 µl, oder 10 µl (kommt auf das Volumen der ÜNK an) pro Eppi und vereinigen)
Auswertung
[Bearbeiten]- DNA-Konzentration im Photometer überprüfen (Verdünnungen z.B. 1:200 oder 1:250; Glasküvette, 500 µl Volumen)
- Auftragen der Proben (z.B. 1 µl) auf ein Agarose-Gel
- Schneiden der Proben (z.B. 1 µl) mit Restriktionsenzymen (möglichst so, daß zwei Fragmente unterschiedlicher Länge entstehen), auftragen auf ein Agarose-Gel
TIPP:
[Bearbeiten]- Bei neuen Konstrukten empfiehlt es sich, ein Eluat in TE-Puffer zu resuspendieren und als Rückstellprobe zu nutzen.
- Wird das präparierte Plasmid zur Cotransfektion in SF9-Zellen genutzt, kann man die DNA-Fällung mit Ethanol im letzten Schritt der Midi-Prep sofort steril durchführen und erspart sich so eine erneute Sterilfällung.
| Tipps added June-05 by Alexander Krupp |
Materialien
[Bearbeiten]- Eis
- 50 ml Falcons
- 2 ml Eppis
- NucleoBond© AX-100 Säule
- Papierfilter
- Bakterienkultur, 30-100 ml
- Puffer S1+RNAse (auf Eis), S2, S3, N2, N3, N5 aus NucleoBond© Kit
- Isopropanol
- Ethanol 70% (4°C)
- TE-Puffer (4°C)
Nucleobond-Puffer
[Bearbeiten]| S1+RNAse | Endkonzentration | 100 ml |
|---|---|---|
| TRIS | 50 mM | 0,6 g |
| EDTA | 10 mM | 0,3 g |
| mit wenigen Tropfen HCl auf pH 8.0 einstellen | ||
| RNAse A | 100 µg/ml | 0,01 g |
| RNAse zunächst in 1 ml Puffer lösen | ||
| S2 | Endkonzentration | 500 ml |
|---|---|---|
| NaOH | 200 mM | 4 g |
| SDS | 1% | 5 g |