Midi-Prep

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Die Midi-Prep zur Gewinnung von Plasmid-DNA aus E. coli

Methode[Bearbeiten]

Anzucht der Bakterienkultur[Bearbeiten]

  1. Kolonie von Platte picken und in in 3-5 ml LB+AMP geben (in 15 ml Falcons; Übertag-Kultur)
  2. Beispiel: 1:250 animpfen! 120 µl in 30 ml LB+AMP geben (in 50 ml Erlenmeyer-Kolben; Übernacht-Kultur)
  3. Bei Bedarf OD600 im Photometer bestimmen

Durchführung der Midi-Prep[Bearbeiten]

Die große Zentrifuge mit 22.50-Rotor auf 4°C bringen, je Midi-Prep ein Zentrifugenröhrchen (lila Deckel) auf Eis stellen. Für Plasmide mit geringer Ausbeute den "low-copy"-Modus verwenden.

  1. Die Übernachtkultur in 50 ml Falcon-Tubes überführen
  2. bei 3500 g für 15 min. bei 4°C in der Zentrifuge in der Gentechnik pelletieren
  3. Überstand verwerfen
  4. resuspendieren in 4 ml (low-copy:8 ml) Puffer S1+RNAse auf Eis
  5. hinzufügen von 4 ml (low-copy:8 ml) Puffer S2
  6. in vorgekühlte Zentrifugenröhrchen (lila Deckel) überführen
  7. mehrmals invertieren, nicht vortexen!
  8. maximal 5 min. bei Raumtemperatur stehen lassen
  9. hinzufügen von 4 ml (low-copy:8 ml) Puffer S3
  10. mehrmals invertieren, nicht vortexen!
  11. für 5 min auf Eis stehen lassen
  12. bei bei Benutzung der SS34-Röhrchen und dazugehörigem Rotor: 15.000g 4°C für 25 min. zentrifugieren

Die Pause kann genutzt werden, um die Tischzentrifuge einzuschalten und auf 4°C zu bringen und die Säule mit 2,5 ml Puffer N2 zu äquilibrieren!

  1. Überstand durch Papierfilter auf Säule geben
  2. Durchlauf nochmals auf Säule geben, um Ausbeute zu erhöhen
  3. Säule mit 2x mit 5 ml Puffer N3 waschen, Durchlauf verwerfen
  4. Säule mit 5x 1 ml Puffer N5 (auf 50°C vorgewärmt, funktioniert auch bei Zimmertemperatur!!!) eluieren, in 2ml-Eppis auffangen
  5. zu jedem Eppi 0,8 ml Isopropanol hinzufügen, 5 mal invertieren
  6. zentrifugieren bei 4°C für 30 min. in der Tischzentrifuge bei 20.000g

Die Pause kann genutzt werden, um 70% EtOH und TE-Puffer bzw. MQ auf Eis zu stellen!

  1. Überstand verwerfen (abpipettieren!)
  2. waschen mit kaltem 1,4 ml 70% EtOH
  3. zentrifugieren bei 15.000g bei 4°C für 10 min.

Die Pause kann genutzt werden, um einen Kaffee zu trinken!

  1. Überstand verwerfen (abpipettieren!)
  2. trocknen (bei Raumtemperatur für 10 min oder bei 37°C für 5 min)
  3. Aufnehmen in kalten TE-Puffer oder MQ (bei Sequenzierung!) (entweder jedes Eppi in 50 µl, 20 µl, oder 10 µl (kommt auf das Volumen der ÜNK an) pro Eppi und vereinigen)

Auswertung[Bearbeiten]

  1. DNA-Konzentration im Photometer überprüfen (Verdünnungen z.B. 1:200 oder 1:250; Glasküvette, 500 µl Volumen)
  2. Auftragen der Proben (z.B. 1 µl) auf ein Agarose-Gel
  3. Schneiden der Proben (z.B. 1 µl) mit Restriktionsenzymen (möglichst so, daß zwei Fragmente unterschiedlicher Länge entstehen), auftragen auf ein Agarose-Gel

TIPP:[Bearbeiten]

  1. Bei neuen Konstrukten empfiehlt es sich, ein Eluat in TE-Puffer zu resuspendieren und als Rückstellprobe zu nutzen.
  2. Wird das präparierte Plasmid zur Cotransfektion in SF9-Zellen genutzt, kann man die DNA-Fällung mit Ethanol im letzten Schritt der Midi-Prep sofort steril durchführen und erspart sich so eine erneute Sterilfällung.
Tipps added June-05 by Alexander Krupp


Materialien[Bearbeiten]

  • Eis
  • 50 ml Falcons
  • 2 ml Eppis
  • NucleoBond© AX-100 Säule
  • Papierfilter
  • Bakterienkultur, 30-100 ml
  • Puffer S1+RNAse (auf Eis), S2, S3, N2, N3, N5 aus NucleoBond© Kit
  • Isopropanol
  • Ethanol 70% (4°C)
  • TE-Puffer (4°C)

Nucleobond-Puffer[Bearbeiten]

S1+RNAse Endkonzentration 100 ml
TRIS 50 mM 0,6 g
EDTA 10 mM 0,3 g
mit wenigen Tropfen HCl auf pH 8.0 einstellen
RNAse A 100 µg/ml 0,01 g
RNAse zunächst in 1 ml Puffer lösen
S2 Endkonzentration 500 ml
NaOH 200 mM 4 g
SDS 1% 5 g