PCR

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Polymerase Chain Reaction (PCR) zum Amplifizieren von DNA-Fragmenten.

Methode[Bearbeiten]

Die zu amplifizierende DNA wird in mehreren Zyklen kopiert, wobei die Zahl der Kopien expotentiell ansteigt. Die Anzahl der Zyklen beträgt in der Regel 20-50, und wird der erwarteten Genauigkeit der Amplifikation angepasst. Jeder der Zyklen besteht prinzipiell aus folgenden Schritten:

  1. Denaturierung der Matrizen-DNA bei 95°C
  2. Hybridisierung (Annealing) der Oligonikleotidprimer an die Enden der Zielsequenz (Temperatur ist abhängig vom Schmelzpunkt der Primer Tm). Je höher die Temperatur, desto spezifischer ist die Hybridisierung
  3. Elongation durch eine hitzestabile DNA-Polymerase bei 72°C (~2 min/1000 Basenpaare)

Standardansatz (50 µl)[Bearbeiten]

  • 5 µl 10× Pfu Puffer
  • 1 µl PCR-Nukleotidmix (dNTP)
  • 1 µl 100 ng/µl Matrizen-DNA (Template); bei Kontrollansatz 1 µl MQ
  • 1,25 µl 100 ng/µl Primer up
  • 1,25 µl 100 ng/µl Primer low
  • 1 µl Pfu-Polymerase
  • 39,5 µl MQ

Standardprogramm[Bearbeiten]

# Min Sec °C Vorgang Zyklen
1. 0 45+ 96 Hotstart
Jetzt Polymerase dazugeben
2. 0 45 96 Denaturieren 20-30×
3. 0 45 55+ Annealing
4. 0 30+ 72 Elongation
5. 10 0 72 Last extension
6. 4 Hold

Hintergrund[Bearbeiten]

Enzyklopädie-Artikel

Merksätze[Bearbeiten]

  • Gelieferte Primer zu 1 µg/µl in MQ lösen.
  • Fremde Templates durch Restriktionsenzymspaltung oder Sequenzierung auf Korrektheit überprüfen!
  • Hast Du keine Primer mehr, fällt die PCR Dir schwer.

Reinigung der PCR-Produkte[Bearbeiten]

Die Reinigung der PCR-Produkte erfolgt über das QIAquick™ PCR Purification Kit. 90-95% der zu reinigen DNA (100 bp - 10 kbp, maximal 10 µg) können angereichert und von restlichen Oligonucleotiden, Nucleotiden, Salzen und Polymerase befreit werden. Die Entfernung der Kontaminationen ist Vorraussetzung für eine effiziente Restriktion und Ligation der PCR-Produkte. Das QIAquick™ PCR Purification Kit wird gemäß den Herstellervorgaben eingesetzt.

  1. Add 5 volumes of Buffer PB to 1 volume of the PCR sample and mix. It is not necessary to remove mineral oil or kerosene. For example, add 500 µl of Buffer PB to 100 ul PCR sample (not including oil).
  2. Place a QIAquick spin column in a provided 2 ml collection tube.
  3. To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column and centrifuge for 30-60 s.
  4. Discard flow-through. Place the QIAquick column back into the same tube. Collection tubes are re-used to reduce plastic waste.
  5. To wash, add 0.75 ml Buffer PE to the QIAquick column and centrifuge for 30-60 s.
  6. Discard Ftow-through and place the QIAquick column back in the same tube. Centrifuge the column for an additional 1 min.
    IMPORTANT: Residual ethanol from Buffer PE will not be completely removed unless the flow-through is discarded before this additional centrifugation.
  7. Place QIAquick column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.
  8. To elute DMA, add 50 µl Buffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) or H2O to the center of the QIAquick membrane and centrifuge the column for 1 min. Alternatively, for increased DNA concentration, add 30 µl elution buffer to the center of the QIAquick membrane, let the column stand for 1 min, and then centrifuge.
    IMPORTANT: Ensure that the elution buffer is dispensed directly onto the QIAquick membrane for complete elution of bound DNA. The average eluate volume is 48 µl from 50 µl elution buffer volume, and 28 ul from 30 µl elution buffer.
  9. Elution efficiency is dependent on pH. The maximum elution efficiency is achieved between pH 7.0 and 8.5. When using water, make sure that the pH value is within this range, and store DNA at -20°C as DNA may degrade in the absence of a buffering agent. The purified DNA can also be eluted in TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0), but the EDTA may inhibit subsequent enzymatic reactions.

Materialien[Bearbeiten]

10× Taq-Polymerase-Puffer[Bearbeiten]

Stoff Endkonzenration für 10 ml
TRIS 100 mM 0,12 g
KCl 500 mM 0,37 g
MgCl2 15 mM 0,03 g
TRIS mit HCl auf pH 8.4 einstellen