Phage Display-DNA Extraktion
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DNA-Extraktion aus Phagen Nach QIAprep® Spin M13 Kit
[Bearbeiten]- Kultivierung einer mit M13 infizierten E. Coli Kultur. 3ml LB – Medium werden 1:100 mit Übernacht – Kultur ER2738 angeimpft. Anschließend wird Plaque einer Titerbestimmung gepickt und zu der Kultur gegeben. Ist kein Plaque vorhanden kann die Kultur auch mit 5µl des Phagen – Überstandes angeimpft werden, wobei aber das Picken von Plaques zu bevorzugen ist. Die Kultur wird 4,5 – 5 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Auch hier gilt, zu lange Inkubation begünstigt Deltionsmutanten und zudem kann es zur Verunreinigung der Proben durch chromosomale DNA von lysierten Zellen kommen.
- Zentrifugation der Kulturen bei 5000rpm für 15min bei RT.
- Abnehmen des Überstandes in frische Reaktionsgefäße. Hierbei darf das Pellet nicht gestört werden, um keine Bakterien zu verschleppen.
- Rezentrifugation des Überstandes wie oben. Hierdurch kann sichergestellt werden, dass der Überstand wirklich sauber ist. WICHTIG: Ein Teil der Phagenlösung (ca. 50µl) sollten aufbewahrt werden, um eine Reserve für spätere Amplifikationen zu haben.
- Zugabe von 1/100 Volumen Puffer MP zur M13 Prezipitation(30µl), anschließend vortexen und bei Raumtemperatur min. 2 min inkubieren. Bei diesem Schritt werden die Phagen aus dem Medium prezipitiert.
- Säule auf ein frisches 2ml Eppendorf – Reaktionsgefäß geben und Auftragen von 700µl der Probe auf das Säulchen. Das Beladen der Säulchen muss in 700µl Schritten erfolgen, da die Säulen nicht mehr Volumen fassen können.
- Zentrifugation 15sec bei 8000rpm und RT in einer Eppendorf – Zentrifuge, Durchfluss verwerfen. Hierbei werden die intakten Phagen auf der Säule zurück gehalten.
- Wiederholung der Schritte 6 und 7 bis die gesamte Probe aufgebracht ist.
- Zugabe von 700µl Puffer MLB, zur M13 Lyse und Bindung, auf das Säulchen. Anschließende Zentrifugation 15sec, 8000rpm, RT. Die Säule wird äquilibriert und die Lyse der Phagen beginnt.
- Zugabe von weiteren 700µl Puffer MLB auf das Säulchen. Inkubation für 1min bei RT zur vollständigen Lyse der Phagen. Zentrifugation: 15sec, 8000rpm, RT. Nach der Lyse werden die Proteine von der bindenden ssDNA getrennt.
- Waschen mit 700µl Puffer PE und Zentrifugation 15sec, 8000rpm, RT. Überschüssiges Salz wird hier entfernt.
- Der Durchfluss wird verworfen und die Säule erneut zentrifugiert, wie oben. In diesem Schritt wird das Ethanol entfernt, welches bei weiteren Reaktionen stören würde.
- Säule auf ein frisches 1,5ml Eppendorf – Reaktionsgefäß geben und Auftragen von 100µl auf 50°C vorgewärmten Puffer EB (10mM Tris/HCl, pH 8,5) in die Mitte der Säulenmembran. Inkubation 10min bei RT und abschließende Zentrifugation für 30sec bei 8000rpm und RT.
- Die Konzentration der erhaltenen DNA wird photometrisch bestimmt (siehe DNA-Konzentrationsbestimmung mit dem Photometer) und kann sequenziert werden.