Phage Display-ELISA

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ELISA der Klone des Phage Display´s

1. Ein Rest (10µl) des Phagen beinhaltenden Überstandes aus der Phagenamplifikation zur DNA-Extraktion muss aufbewahrt werden
2. Für jeden zu charakterisierenden Klon werden 20ml LB-Medium mit einer Übernacht-Kultur von ER2738 1:100 angeimpft.
3. Die 20ml Kultur wird mit 5µl Phagen Überstand angeimpft und 4,5 h bei 37°C unter schütteln inkubiert.
4. Die Kultur wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 10 min bei 10.025g zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Röhrchen gegeben und erneut zentrifugiert, wie oben.
5. Die oberen 80% des Überstandes werden in ein neues Röhrchen gegeben (ca. 15ml) und 1/6 des Volumens (2,5ml) PEG/NaCl zugegeben. Kurz mischen und mindestens 1 Stunde, oder besser über Nacht bei 4°C die Phagen präzipitieren lassen.
6. Das Präzipitat wird 15 min bei 10.025g und 4°C pelletiert. Der Überstand wird abgegossen, das Präzipitat kurz erneut zentrifugiert und der restliche Überstand mit einer Pipette vollständig abgenommen.
7. Das verbleibende Pellet wird in 1ml TBS resuspendiert, in ein Eppendorf Reaktiongefäß transferiert und anschließend 5min bei 4°C und max rpm zentrifugiert.
8. Der Überstand wird in ein neues Eppendorf Reaktiongefäß überführt und erneut mit 1/6 des Volumens (167µl) PEG/NaCl versetzt. Anschließend wird das Gemisch 15-60 min auf Eis inkubiert.
9. Der Ansatz wird anschließend für 10 min bei 4°C und max rpm zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Rest des Überstandes nach kurzem erneutem zentrifugieren mit der Pipette abgenommen.
10. Das Pellet wird in 50µl TBS resuspendiert, und der Titer der Lösung bestimmt.
11. Eine Reihe pro zu untersuchenden Klon einer Microtiter-Platte (96-Well) wird mit 100-200µl einer 100µg/ml Zielproteinlösung in 0,1M NaHCO3 (pH 8,6) gecoatet, eine weitere Reihe pro Klon wird nicht gecoatet. Die Platte wird über Nacht bei 4°C in einer feuchten luftdicht verschlossenen Box inkubiert.
12. Die überschüssige Lösung wird abgenommen, indem die Platte umgekehrt auf ein Stück Küchenrolle ausgeschlagen wird. Anschließend wird jede Vertiefung vollständig mit Blockpuffer gefüllt. WICHTIG: Zusätzlich sollte eine Reihe pro zu untersuchenden Klon nur geblockt werden, um die Bindung des Klons gegen BSA geblocktes Plastik zu untersuchen. Zudem wird eine weitere Microtiter-Platte geblockt, um später darin die Phagen Verdünnungen vor zu nehmen, damit die Phagen nicht schon bei der Verdünnungen an das Zielprotein binden. Die Blocklösung wird 1-2 Stunden bei 4°C inkubiert.
13. Der Blockpuffer der Verdünnungsplatte wird verworfen und die Platte 6 mal mit 1x TBS/Tween gewaschen. Hierbei sollte die Konzentration an Tween gleich der Konzentration, die bei den Selektionsschritt verwandt wurde.
14. Während die Zielproteinplatte weiter geblockt wird, wird eine serielle Verdünnung der Phagen in TBS/Tween (s.o.) durch geführt. Das Manual gibt an: Start 1.Reihe mit ca. 2,5 *1011 Phagen (in 200µl => 4/3 * 2,5 * 1011 pfu in 270µl) und nach rechts vierfache Verdünnungen vornehmen bis hin zu ca. 5* 104 Phagen. Es reichen aber auch 10fach Verdünnungen von 1010 – 107 für eine erste Orientierung aus. (Spart Platz, Protein, Zeit, Nerven und so manche kalte Nase.)
15. Die Zielproteinplatte wird gewaschen wie in Schritt 13.
16. Die Phagenverdünnungen (200µl) werden auf die Zielproteinplatte aufgebracht, wobei mit der geringsten Konzentration angefangen wird. Anschließend wird der Ansatz für eine Stunde bei RT unter Schütteln inkubiert
17. Die Zielproteinplatte wird 6 mal gewaschen s.o.
18. Der 1. Antikörper (α-FD Bacteriophage / rabbit) wird 1:5000 verdünnt in Blockpuffer. 200µl der ersten Antikörperlösung werden aufgebracht und anschließend 1 Stunde bei RT unter Schütteln inkubiert.
19. Die Zielproteinplatte wird 6 mal gewaschen s.o.
20. Der 2. Antikörper (α-rabbit / goat / HRP konjugiert) wird 1: 20000 verdünnt in Blockpuffer. 200µl der zweiten Antikörperlösung werden aufgebracht und anschließend 1 Stunde bei RT unter Schütteln inkubiert. WICHTIG: 2. AK immer frisch ansetzen, die Peroxidase ist sehr empfindlich.
21. Die Zielproteinplatte wird 6 mal gewaschen s.o.
22. Zur Kontrolle, ob die Peroxidase des 2.AK noch funktionstüchtig ist wird in eine Vertiefung 50µl der 2.AK-Lösung gegeben und nicht ausgewaschen.
23. Das Substrat für die HRP wird hergestellt.
    • (TMB)- Substrat: 120mg TMB + 2,5ml DMSO (Dimethyl-Sulfon-Oxid) + 2,5ml Ethanol
    • GALLATICHRIS-Puffer: 4,2g tri-Natriumcitrat-2-Hydrat lösen in 50-60 ml MQ mit HCl auf pH-Wert 3,95 einstellen und auf 100ml mit MQ auffüllen. Anschließend wird zur Fertigstellung 34µl 30%tiges H2O2 dazu gegeben (in dunkler Flasche ca. 3 Wochen im Kühlschrank lagerbar).
    • TMB-Färbepuffer: 1% TMB-Substrat in GALLATI-CHRIS-Puffer
    • STOP-Puffer: 2M H2SO4
24. Die Farbreaktion wird gestartet durch Zugabe von 200µl des TMB-Färbepuffer. Anschließend wird die Platte 10 Minuten im dunkeln bei RT unter Schütteln inkubiert. Dabei entsteht eine abgestufte Blaufärbung in den einzelnen Vertiefungen.
25. Die Farbreaktion wird gestoppt durch Zugabe von 100µl STOP-Puffer. Dabei schlägt die Farbe um zu einem Gelb.
26. Diese Färbung kann dann bei 450nm in einem Microtiterplatte ausgemessen werden. (595nm/415nm) leider schlecht, am besten mit unseren Mitteln (490nm/595nm)
27. Fotographie der Platte zur optisch-quantitativen Auswertung.