Phage Display-Selektion
Selektionsschritt PhD[Bearbeiten]
Erster Tag
1.Lösung des Zielproteins 0,1µg/µl in 0,1M NaHCO3 herstellen. Als Kontrolle anstatt des Zielproteins Streptavidin (im Lieferumfang des Kits vorhanden) benutzen.
2.150µl der Lösung werden in die Vertiefung einer Microtiterplatte aufgebracht, wobei darauf zu achten ist, dass die gesamte Oberfläche benetzt wird.
3.Anschließend wird die Microtiterplatte über Nacht bei 4°C inkubiert in einer feuchten Umgebung (Glasschale mit feuchtem Apura-Papier).
4.Austreichen von Escherichia coli ER2738 von Glycerol-Stock ( im Lieferumfang des Kits vorhanden) auf LB-Tet Platten.
Zweiter Tag
5.Animpfen von 10ml LB-Medium mit ER2738 von der Platte (Für spätere Titerbestimmung der Eluate) und animpfen von 20ml LB-Medium pro zu untersuchendem Protein je in einem 250ml Erlenmeyerkolben. Inkubation bei 37°C unter heftigem Schütteln (180rpm – 230rpm).
6.Abnehmen der Zielproteinlösung aus jeder gecoateten Vertiefung. Hierzu wird die Platte kräftig mit der Oberseite nach unten auf ein sauberes Stück Küchenrolle oder Apura-Papier geschlagen, bis keine Feuchtigkeit mehr herauskommt. Anschließend wird jede gecoatete Vertiefung komplett mit Blocklösung (0,1M NaHCO3 (pH 8,6), 5mg/ml BSA, 0,02% NaN3) gefüllt und die Platte mindestens eine Stunde bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Während dieser Zeit wird TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20) hergestellt. Für die Streptavidin – Kontrolle wird 1µg/µl Streptavidin zum Blockpuffer gegeben, um jegliches Biotin in der Lösung zu komplexieren.
7.Die Blocklösung wird abgenommen, wie in Schritt 6 und jede Vertiefung wird 6mal mit TBST gewaschen. Hierzu werden 300µl der Lösung zugegeben und direkt wieder abgenommen und anschließend die Platte wieder auf einem Papierhandtuch getrocknet. Es sollte schnell gearbeitet werden, um ein Austrocknen zu verhindern.
8.4* 1010Formel hier einfügen Phagen (10µl der Original Bibliothek) wird in 100µl TBST verdünnt. Diese Lösung wird in die Vertiefung pipetiert und unter leichtem Schütteln für 10-60 min bei RT inkubiert.
9.Die Nichtgebundenen Phagen werden durch erneutes Ausschlagen verworfen und die Platte anschließend 10mal mit TBST gewaschen wie in Schritt 7, wobei immer frisches Papier benutzt wird, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. 10.Eluiert werden die Phagen mit 100µl 0,2M Glycin/HCl (pH 2,2), 1mg/ml BSA Elutions Puffer. Dieser wird zugegeben und die Platte höchstens 10 Minuten bei RT unter schütteln inkubiert. Das Eluat wird abgenommen und mit 15µl 1MTris/HCl (pH 9,1) neutralisiert. Dies ist das 1. Eluat. Für die Streptavidin – Kontrolle wird 0,1mM Biotin in TBS als Elutions Puffer genommen.
11.Von einem kleinen Teil des Eluats (2-3µl) wird der Titer bestimmt (siehe M13-Titerbestimmung). An diesem Punkt kann das Eluat über Nacht aufbewahrt werden. Dann wird am nächsten Tag mit Punkt 12 fortgefahren, sonst...
12.Der Rest des Eluates wird zu den in Punkt 5 angeimpften 20ml Kulturen gegeben und bei 37°C unter kräftigen schütteln für 4,5 Stunden inkubiert.
13.Die Kultur wird in ein sauberes Zentrifugen-Röhrchen gegeben und für 10 Minuten bei 10.025g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Tube gegeben und erneut zentrifugiert.
14.Die oberen 80% des Überstandes (ca. 15ml) werden in ein frisches Zentrifugen-Röhrchen überführt und 1/6 dieses Volumens (2,5ml) an PEG/NaCl hinzu pipetiert. Anschließend werden die Phagen mindestens eine Stunde bei 4°C prezipitiert (oder auch über Nacht).
Dritter Tag oder zweiter Abend
15.Das PEG-Prezipitat wird für 15 Minuten bei 10.025g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Rest kurz erneut zentrifugiert, woraufhin der restliche Überstand mit einer Eppendorfpipette abgenommen wird.
16.Das Pellet wird in 1ml TBS resuspendiert, in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und anschließend für 5min bei max. rpm und 4°C in einer Eppendorf – Zentrifuge zentrifugiert, um restliche Zellen zu pelletieren.
17.Der Überstand wird in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben und reprezipitiert mit 166,7µl PEG/NaCl. Der Ansatz wird 15-60 min auf Eis inkubiert und anschließend für 10 min bei max rpm. und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und nach kurzen erneutem zentrifugieren der restliche Überstand mit einer Eppendorfpipette abgenommen.
18.Das Pellet wird in 200µl TBS,0,02% NaN3 gelöst. Die Lösung wird ein letztes mal für 1min bei max rpm und 4°C zentrifugiert, um die letzten unlöslichen Bestandteile zu pelletieren und der Überstand in ein frisches Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Bei der Lösung handelt es sich um das amplifizierte 1. Eluat.
19.Von dem amplifizierten Eluat wird eine Titerbestimmung durchgeführt und der Rest bei 4°C aufbewahrt.
20.Eine Vertiefung einer Microtiterplatte wird wie in den Punkten 1-3 beschrieben gecoatet.
Vierter und fünfter Tag (Dritter Tag)
21.Der Phagentiter wird anhand der blauen Plaques bestimmt, um berechnen zu können, welches Volumen einem Titer von 1-2 * 1011 pfu entspricht. Bei zu geringem Titer kann die Selektion mit einer Menge von nur 109 Phagen durchgeführt werden.
22.Eine zweite Selektionsrunde wird durchgeführt wie in den Schritten 6-19, wobei im Gegensatz zu der ersten Runde 1-2 * 1011 pfu des ersten Eluats genutzt werden. Zudem wird die Konzentration an Tween 20 in den Waschschritten auf 0,5% [v/v] erhöht, um unspezifische Wechselwirkungen mit dem hydrophoben Plastik zu verringern.
23.Der Titer des zweiten Eluates wird mit Hilfe der IPTG/Xgal Platten bestimmt und der Rest bei 4°C aufbewahrt.
24.EineVertiefung einer Microtiterplatte wird wie in den Punkten 1-3 beschrieben gecoatet.
Siebter Tag (Vierter Tag)
25.Der Phagentiter wird bestimmt, so dass die dritte Selektionsrunde mit 1-2 * 1011 pfu nach den Punkten 6-19 durchgeführt wird. Auch in der dritten Selektionsrunde wird die Tween Konzentration in den Waschschritten bei 0,5% [v/v] gehalten.
26.Der Titer des unamplifizierten Eluates der dritten Runde wird nach dem Protokoll der M13 Titerbestimmung bestimmt, wobei darauf zu achten ist, dass von diesen Platten später Plaques gepickt werden sollen, weshalb darauf zu achten ist, dass die Platten nicht länger als 18 Stunden inkubiert werden, da sonst Deletionen in den Peptiden auftreten und amplifiziert werden können. Das restliche Eluat wird bei 4°C aufbewahrt.
ANMERKUNG: Die Eluate, sowie die einzelnen gepickten Klone können für mehrere Wochen mit geringem Verlust des Titers im Kühlschrank aufbewahrt werden, für eine längere Lagerung jedoch sollte ein Glycerolstock angelegt werden, indem zu der vorhandenen Menge an Phagensuspension die gleiche Menge an autoklavierten 100% igen Glycerol gegeben wird. Die Ansätze werden anschließend sehr gründlich gemischt (vortexen) und anschließend bei -20°C gelagert.
27.Eine neue ER2738 Übernacht-Kultur wird angesetzt, indem eine Kolonie von der Platte gepickt wird.