IGF 2 µg/µl, 34 kDa
Peptid 1,5 µg/µl, 5 kDa
6 verschiedene molare Verhältnisse (1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100)
5 verschiedene Zeiten (0, 5, 15, 30, 60 Minuten)
Reaktion findet bei Raumtemperatur statt
Konzentration (in picoMol)
Cx [pmol/µl]=
1.000 * Cx [µg/µl]
MWx [kDa]
Daher:
IGF : 58,8 pmol/µl
Peptid : 300 pmol/µl Endkonzentration IGF soll 2 µM/µl betragen
Berechnung der µl IGF pro Ansatz
x =
2 µM * 70 µl
= 2,38 µl = ca. 2,4 µl
58,8 pmol/µl
6 Ansätze à 70 µl
IGF:Peptid
IGF
Peptid
KP
TRIS
1:1
2,4 µl
0,4 µl
7 µl
60,2 µl
1:10
2,4 µl
4,6 µl
7 µl
56,0 µl
1:20
2,4 µl
9,3 µl
7 µl
51,3 µl
1:30
2,4 µl
14,0 µl
7 µl
46,6 µl
1:50
2,4 µl
23,3 µl
7 µl
37,3 µl
1:100
2,4 µl
46,6 µl
7 µl
14,0 µl
TRIS : 50mM pH7.5; KP = 10× Kinasepuffer molare Verhältnis
5 Zeitwerte × 6 molare Verhältnisse = 30 Eppis vorbereiten, SDS-Probenpuffer oder Quenching-Puffer (für native Gelelektrophorese ) in jedes Eppi geben Alles bis auf Kinasepuffer zusammenpipettieren
Ggfs. Nullwerte (Zeit=0) entnehmen (nur 6 µl)
Zeit startet bei der Zugabe von Kinasepuffer; festes Zeitschema wählen (z.B. 20 Sekunden pro Ansatz)
Bei jedem Zeitwert aus jedem Ansatz 10 µl entnehmen (Zeitschema beachten), in vorbereitetes Eppi geben, ggfs. kurz anzentrifugieren (bei Verwendung von Quenching-Puffer Eppi auf Eis stellen)
Die Proben können über Nacht bei -20°C gelagert werden
10×
100 µl
ATP 100 mM
20 µl 0,5M oder 40 µl 0,25M
MgCl2 200 mM
30 µl 1M
TRIS pH 7.5 50 mM
10 µl 0,5M
DTT 10 mM
1 µl 1M
TRIS
39 (bzw. 19) µl 50mM pH 7.5
!ATP in 50 mM TRIS oder HEPES auf pH 7.0 einstellen!
4×
100 µl
10 ml
EDTA 0,5M
50 µl
5 ml
TRIS 3M
12,5 µl
1,25 ml
1M DTT
10 µl
1 ml
Saccharose 60%
26,5 µl
2,65 ml
1% Bromphenolblau
1 µl
100 µl
