Plaque Assay

Plaque Assay zur Herstellung von Virusklonen und zur Bestimmung des Virustiters.

Abkürzungen:[Bearbeiten]

MOI : multiplicity of infection, = plaque forming units pro Zelle
Pfu : plaque forming units

Zellen zählen, sollen in log-Phase (1,0-1,2×10⁶/ml) sein und gesund
kleine Petrischalen (ca. 4,5cm Durchmesser): für jede Verdünnungen (1. Überstand Beginn mit 10^-2 und 2. Überstand Beginn mit 10^-3) zwei Schalen beschriften (Doppelbestimmung), zusätzl. Nullwert. An einer Seite mit senkrechtem Strich markieren, dort wird zu- und abpipettiert
ca. 2ml Medium in jede Petrischale geben, verteilen
in jede Schale 1,5-2,0×10⁶ Zellen geben, verteilen, ca. 10-15 min stehen lassen, bis die Zellen angeheftet sind (Mikroskop)

zwischenzeitlich:

- Virus (Virusüberstand) mit Medium (AB+) verdünnen (je 2,7ml Medium + 300µl Überstand); Eppendorfpipette mit Ethanol außen und innen reinigen
- beim ersten Assay nach der Transfektion: 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, später stärker verdünnen, so dass 3 Konzentrationsbereiche ausgewertet werden können
Medium aus den Schalen mit steriler Pasteurpipette, Schlauch und Vakuumpumpe absaugen (Schlauch außen und innen mit Ethanol reinigen); zum Absaugen Schälchen schräg halten, an markierter Stelle absaugen
sofort 1ml Virusverdünnung auf die Zellen geben, je 2 Schälchen; mit Nullwert (+Medium) beginnen, dann höchste Virusverdünnung
Schälchen in große Petrischale legen, im Brutschrank für 1h inkubieren, dabei alle 15 min bewegen
Wasserbad auf 45°C anstellen. Für jede Petischale wird 5 ml Agarosemedium (0,5 %) benötigt. Dafür nötiges Medium (etwas mehr) auf 2 Falcons aufteilen und bei 45°C warmstellen. Agarose (Seakem Agarose, 5% in Wasser) in der Mikrowelle aufkochen
Sobald das Medium warm ist, 1/10 Endvolumen Agaroselösung zugeben, vortexen, und ins 40°C Wasserbad stellen, bzw. das Wasserbad mit Medium auf 40°C abkühlen lassen
Überstand aus den Schälchen absaugen. Wichtig: Alles Medium entfernen. Dazu 1ml Eppendorfpipette benutzen. Sofort vorsichtig 5 ml Agarosemedium zugeben. (je eine 10ml Pipette / Verdünnung)
Petrischälchen halb geschlossen unter der Sterilbank stehenlassen, bis die Agarose fest ist (ca 15 min)
Eine große Petrischale mit einem feuchten Papiertuch auslegen, Schälchen darin im Brutschrank 6-10 Tage inkubieren, bis der Boden mit Zellen zugewachsen ist. Danach sollten die Plaques als durchscheinende Flecken im Zellrasen sichtbar sein

Sichtbarmachen der Plaques mit Neutralrot[Bearbeiten]

Neutralrot: Stock 1mg/ml in incomplete Grace-Medium, sterilfiltriert, bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.

pro Schälchen werden 3 ml Lösung benötigt. Benötigtes Medium mit 1/20 des Endvolumens mit Neutralrot versetzen und bei 45°C warmstellen. In 2 Falcons aufteilen, siehe Agaroselösung beim Plaqueassay
Agarose in der Mikrowelle aufkochen, 1/10 des Endvolumens zum Medium geben, ins 42°C Wasserbad stellen (ca. 30 min)
3 ml davon vorsichtig auf die Petrischalen geben, (10er Einmal-Pipette benutzen, bis 12 ml aufziehen, 4 Schälchen damit überschichten); offen stehenlassen, bis die Agarose erstarrt ist
nach einigen Stunden und am nächsten Tag kontrollieren: Plaques erscheinen hell im roten Zellrasen

Picken von Plaques[Bearbeiten]

Plaques am Boden des Schälchens mit Glasschreiber markieren
mit kurzer Pasteurpipette (mit Hütchen) von oben senkrecht anstechen und Agarpfropfen vorsichtig hochsaugen
in 1 ml Medium aufnehmen, in 15 ml Falcon geben, whirlmixen
10 bis 20 Plaques picken; können im Kühlschrank aufbewahrt werden