Plasmid-DNA-Minipräparation durch Phenol-Chloroform
Plasmid-DNA Präparation durch Phenol-Chloroform Extraktion Diese Methode der Plasmidpräperation liefert große Mengen an DNA. Die Ausbeute von 10ml ist durchaus mit der Midi-Prep zu vergleichen. Jedoch: Sowohl Chloroform als auch Phenole sind giftig! Daher muss diese Methode im Abzug zurchgeführt werden. Auch die Abfälle sind gesondert zu behandeln
Methode
[Bearbeiten]- 2ml LB-Medium (Versetzt mit entsprechendem Antibiotikum) mit Einzelkultur animpfen
- Inkubation über Nacht in Schüttler bei 220rpm, 37°C
- 1,5ml In Eppendorfgefäss überführen
- 1 min bei 14000rpm in Tischzentrifuge Bakterienzellen abzentrifugieren
- Überstand entfernen
- Pellet in 100µl Lösung 1 resuspendieren
- Zugabe von 200µl Lösung 2
- Eppi 5x invertieren und auf Eis stellen
- Zugabe von 150µl eiskalter Lösung 3
- 10 sek. Vortexen und 3-5min auf Eis stellen
- 5 min bei 14000 rpm und 4°C zentrifugieren
- Den Überstand in ein neues Eppi überführen
- Zugabe von 450µl Phenol-Chloroform-Lösung und vortexen
- Zentrifugation für 2min bei 14000 rpm, 4°C
- ÜBERSTAND in ein neues Eppi überführen
- Zugabe von 450µl Chloroform und vortexen
- Zentrifugation für 2min bei 14000 rpm, 4°C
- ÜBERSTAND in ein neues Eppi überführen
- Zugabe von 450µl Chloroform und vortexen
- Zentrifugation für 2min bei 14000 rpm, 4°C
- ÜBERSTAND in ein neues Eppi überführen
- Zugabe von 900µl eiskaltem 100% EtOH und vortexen
- 20min bei -20°C stehen lassen
- Zentrifugieren für 5 min bei 14000 rpm, 4°C
- Überstand entfernen
- Waschen mit eiskaltem 70°C EtOH
- Zentrifugieren für 5 min bei 14000 rpm, 4°C
- Überstand entfernen
- Pellets trocknen lassen (evtl. bei 37°C
- Resuspendieren in 30µl Puffer S1 mit RNAse
Material
[Bearbeiten]Lösung 1 (50ml)
- 50mM Glukose (0,5g)
- 25mM Tris-Hcl pH 8,0 (1,25ml 1M Tris-HCl pH 8,0)
- 10mM EDTA pH 8,0 (1ml 0,5M EDTA)
Lösung 2
- 0,2 N NaOH
- 1% SDS
Lösung 3
- 5M K-Acetat 60ml
- 100% Essigsäure 11,5ml
- MQ 28,2ml