Plasmid-DNA-Minipräparation durch Phenol-Chloroform

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Plasmid-DNA Präparation durch Phenol-Chloroform Extraktion Diese Methode der Plasmidpräperation liefert große Mengen an DNA. Die Ausbeute von 10ml ist durchaus mit der Midi-Prep zu vergleichen. Jedoch: Sowohl Chloroform als auch Phenole sind giftig! Daher muss diese Methode im Abzug zurchgeführt werden. Auch die Abfälle sind gesondert zu behandeln

Methode[Bearbeiten]

  • 2ml LB-Medium (Versetzt mit entsprechendem Antibiotikum) mit Einzelkultur animpfen
  • Inkubation über Nacht in Schüttler bei 220rpm, 37°C
  • 1,5ml In Eppendorfgefäss überführen
  • 1 min bei 14000rpm in Tischzentrifuge Bakterienzellen abzentrifugieren
  • Überstand entfernen
  • Pellet in 100µl Lösung 1 resuspendieren
  • Zugabe von 200µl Lösung 2
  • Eppi 5x invertieren und auf Eis stellen
  • Zugabe von 150µl eiskalter Lösung 3
  • 10 sek. Vortexen und 3-5min auf Eis stellen
  • 5 min bei 14000 rpm und 4°C zentrifugieren
  • Den Überstand in ein neues Eppi überführen
  • Zugabe von 450µl Phenol-Chloroform-Lösung und vortexen
  • Zentrifugation für 2min bei 14000 rpm, 4°C
  • ÜBERSTAND in ein neues Eppi überführen
  • Zugabe von 450µl Chloroform und vortexen
  • Zentrifugation für 2min bei 14000 rpm, 4°C
  • ÜBERSTAND in ein neues Eppi überführen
  • Zugabe von 450µl Chloroform und vortexen
  • Zentrifugation für 2min bei 14000 rpm, 4°C
  • ÜBERSTAND in ein neues Eppi überführen
  • Zugabe von 900µl eiskaltem 100% EtOH und vortexen
  • 20min bei -20°C stehen lassen
  • Zentrifugieren für 5 min bei 14000 rpm, 4°C
  • Überstand entfernen
  • Waschen mit eiskaltem 70°C EtOH
  • Zentrifugieren für 5 min bei 14000 rpm, 4°C
  • Überstand entfernen
  • Pellets trocknen lassen (evtl. bei 37°C
  • Resuspendieren in 30µl Puffer S1 mit RNAse


Material[Bearbeiten]

Lösung 1 (50ml)

  • 50mM Glukose (0,5g)
  • 25mM Tris-Hcl pH 8,0 (1,25ml 1M Tris-HCl pH 8,0)
  • 10mM EDTA pH 8,0 (1ml 0,5M EDTA)

Lösung 2

  • 0,2 N NaOH
  • 1% SDS

Lösung 3

  • 5M K-Acetat 60ml
  • 100% Essigsäure 11,5ml
  • MQ 28,2ml