Proteinexpression

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Abkürzungen:

• MOI : multiplicity of infection,
• Pfu : plaque forming units pro Zelle

Zeitabhängigkeit der Expression

1. Spinnerflasche mit ca. 200 ml Medium,(ca. 1,15×10⁶ Zellen/ml) Zellen für t = 0 abnehmen
2. für 10 min bei 1800 rpm abzentrifugieren
3. Zellpellet in 20 ml Medium + Virusüberstand P3 suspendieren. (MOI ~ 5)
4. in den Spinner zurückgeben und im Brutschrank für 1 Stunde inkubieren. Alle 15 min schwenken
5. mit Medium auffüllen (hier: auf 150 ml, Zelldichte ~ 1,25×10⁶), Zellen zählen
6. möglichst im 12 Stunden Abstand (z.B.: 1; 18,5; 24; 43,5; 48,5; 67,5; 72) Zellen zählen, jeweils 5 ml Zellsuspension abnehmen, bei 2300 rpm 5 min zentrifugieren, Pellet in gleichem Volumen eiskaltem PBS-Puffer waschen, und Pellets einfrieren
   Wenn man ungefähr weiß, zu welchem Zeitpunkt die Expression optimal ist, empfiehlt es sich, eine größere Portion abzunehmen und für Extraktionsvorversuche zu verwahren
7. Aufschluß der Zellen: Jedes 5ml-Pellet in 500 ml Lysispuffer (~10⁷ Zellen/ml) aufgetaut, 5 s bei 100 W beschallt, bei 14.000 rpm in der Eppendorf-Zentrifuge im Kühlraum für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird bei -20°C zur Elektrophorese verwahrt

Proteinexpression

1. gut wachsende Zellen, im Labor üblich 1,5-1,6x10⁶/ml, (Pharmingenangabe 2×10⁶/ml)
2. abzentrifugieren in 4 × 50 ml Röhrchen, 1800 rpm , 10 min, RT
3. das Pellet in Virusüberstand resuspendieren (MOI 5 oder 10), V = 20 ml, (MOI=Multiplicity of Infection)
4. Suspension in den Spinner zurückgeben und 1 h im Brutschrank inkubieren; alle 15 min schwenken
5. nach 1 h den Spinner mit Medium auf 200 ml auffüllen,
6. für die vorher im Zeitversuch ermittelte Inkubationszeit im Brutschrank inkubieren

Ernte der Zellen

1. Zelldichte ermitteln
2. Zellen gleichmäßig auf große Falcons verteilen
3. zentrifugieren: 2300 rpm, 10 min, 18°C
4. Pellets lockern (übers Gitter der Sterilbank ziehen), in jeweils 20-25 ml eiskaltem PBS-Puffer resuspendieren, ev. Pellets vereinigen
5. zentrifugieren: 2300 rpm, 10 min, 4°C
6. Pellets einfrieren in flüssigem N₂, bei -80°C lagern

Lyse der Zell-Pellets

Ohne GST.

1. Tiefgefrorene Pellets der Expression mit Lysispuffer versetzen und darin auftauen. Pro 10⁸ Zellen 10 ml Lysispuffer verwenden
2. Im Glas/Teflonhomogenisator 10× pottern
3. Beschallen: 5 × 5 sec (Intervall 0,5, 80%), zum Kühlen auf Eis
4. DTT zur Endkonzentraton 1mM (aus 100× Stock)zugeben
5. Zentrifugieren: 10 min, 10.000g, 4°C
6. Überstand in Ultrazentrifugenröhrchen geben,
7. in der Ultrazentrifuge bei 40.000 rpm für 45 min zentrifugieren
8. Überstand = Lysat, Aliquots entnehmen zur Elektrophorese
9. Lysat in N₂ schockgefrieren in 8ml Aliquots

Mit GST:nach dem Beschallen Triton zur Endkonzentration 1% zugeben (aus 20% Stock)

Lysispuffer

• 20 mM Tris-HCl PH 7.5
• 0,25 M Sucrose
• Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail (je nach anschließender Reinigung mit oder ohne EDTA)
  

andere mögliche Proteaseinhibitoren (alt):

• 1 mM PMSF (aus 100× Stock)
• 10 µg/ml Leupeptin (aus 1000× Stock) oder Complete-Tabletten (1 Tablette/50 ml)

Beckmann Ultrazentrifuge

• Rotor Ti 70 40000 rpm = 146944 g
• Rotor Ti 45 40000 rpm =186010 g