Proteinexpression groß

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Vorbereitung

1. 2-5 ml Übertag-Kultur in LB+AMP Medium, bei 37°C und 220 rpm im Schüttler
2. Abends 100 µl - 5 ml in 100 ml LB+AMP Medium geben, über Nacht bei 37°C und 180 rpm im Schüttler

Je nach Bakterienstamm (z.B. BL21-RIPL) muss den Medien neben Ampicillin auch Chloramphenicol zugesetzt werden. Für BL21-RIPL: 35 µg Chloramphenicol pro ml

Vorbereitung bei Vorhandensein eines Glycerol-Stocks

Abends etwas vom Glycerol-Stock abkratzen und in 100 ml LB+AMP Medium geben, über Nacht bei 37°C und 180 rpm im Schüttler

Tag 1:

1. 100 ml-Kulturen in 900 ml LB+AMP Medium geben, im Schüttler bei 37°C und 180 rpm, halbstündlich Probe im Photometer überprüfen, bis OD₆₀₀ zwischen 0,44 und 0,6 liegt
2. Zugabe von 100 µl 1M IPTG, Endkonzentration 100 µM
3. 3 h im Schüttler bei 37°C und 180 rpm
4. Die 1 l-Kultur auf Zentrifugenbecher verteilen
5. Zentrifugieren bei 3.500 rpm, 15 min, 4°C in zwei 500 ml-Zentrifugenbechern
6. Überstand verwerfen, in je 20 ml PBS-Puffer resuspendieren
7. In kleine Zentrifugenröhrchen überführen
8. Zentrifugieren bei 5.000 g, 15 min, 4°C
9. Überstand verwerfen und direkt zu Punkt 11; alternativ in je 20 ml PBS-Puffer resuspendieren
10. In Falcons überführen
11. In flüssigem Stickstoff schockgefrieren
12. Über Nacht bei -70°C lagern

Tag 2: Zellaufschluss

1. Pellets auftauen und in 20 ml PBS (oder TBS) resuspendieren, in kleine Zentrifugenröhrchen überführen
2. je 20 ml-Suspension wie folgt durchgehen:
3. 200 µl 100× PMSF hinzugeben
4. 20 µl 1M DTT (frisch ansetzen) dazugeben (Endkonzentration 1mM)
5. 20 µl 1000× Leupeptin
6. 3 × 5 Sekunden sonifizieren bei 70W (alternativ: 6 × 5 Sekunden auch möglich, höhere Ausbeute an Protein!)
7. je Triton-X-100 dazugeben, Endkonzentration 1% (z.B. 1 ml 20% Triton-X-100 auf 20 ml)
8. resuspendieren
9. Zentrifugieren bei 10.000g, 15 min, 4°C
10. Überstand weiterverwenden

Materialien

• Tag 1 : LB+AMP Medium, IPTG, PBS-Puffer, flüssiger Stickstoff
• Tag 2 : PMSF, DTT, Leupeptin, Triton-X-100

• Leupeptin 1000×
  • 10 mg Leupeptin (M_W als Hemisulfat-Monohydrat 542,7 g/mol) auf 1 ml MQ; in 50µl oder 100µl Aliquots aufteilen, bei -20°C aufbewahren, Leupeptin ist ein allgemeiner Protease-Inhibitor
• PMSF 100×
  • Phenylmethylsulfonylfluorid
  • 88 mg PMSF (M_W = 174,2 g/mol) auf 15 ml Isopropanol (= 220 mM); in Falcon bei 4°C aufbewahren, PMSF ist ein Serinprotease- Inhibitor
• DTT
  • M_W=154,2 g/mol; 7,71 mg/50 µl