Urea-PAGE

Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese mit Harnstoff zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen. Nach Größe werden Proteine getrennt. Urea-Gel kann phosphoryliertes Protein von unphosphoryliertem Protein mit größerem Abstand als SDS-PAGE trennen.

Methode[Bearbeiten]

10 ml Trenngel (+APS+TEMED) in Glassplatten-Sandwich geben
mit etwas MQ bedecken
ca. 45 min warten, bis das Gel fest wird
MQ abgießen oder mit Filterpapier entfernen
Sandwich mit Sammelgel (+APS+TEMED, ca. 5 ml) füllen
Kamm einsetzen
ca. 30 min warten, bis das Gel fest wird
Unterseite der Slots mit Stift markieren
Sandwich in Laufkammer stellen (weiße Platte zur Mitte hin orientieren)
Mitte der Laufkammer mit Harnstoffgel-Laufpuffer füllen, so dass die Slots bedeckt sind.
Den äußeren Bereich der Kammer zu etwa 1/3 mit Laufpuffer füllen
Proben mit Hamilton-Pipette in die Slots geben, Pipette nach jeder Probe in Laufpuffer spülen
Mit 290 Volt laufen lassen. Alternative:
1. Beim Raumtemperatur läuft die Färbungsfront bei 26min aus, und das Gel soll ca. 1h laufen.
2. Bei 0,5°C konnten wir gute Ergebnisse mit Laufzeiten von 2h30' erzielen (zur Trennung von phosphoryliertem und unphosphoryliertem tyrTide).
Kammer in den Ausguss entleeren, sehr gründlich mit Wasser spülen

optional:
Harnstoffgele konnten gut gefärbt und anschließend auch in MQ entfärbt werden (ohne dass sich die Proteinbanden entfärbten).
Zur Trocknung Gel Ü/N in MQ entfärben, dann für 2h in 20% Glycerin legen und für 30' bei 80°C und für 20' bei offenem Deckel unter Vakuum trocknen.

Materialien[Bearbeiten]

Andere Materialien[Bearbeiten]

APS=40% Ammonium-Persulfat ( 0,1g auf 250 µl ansetzen, hält ca. 2-3 Tage)
240mM Tris-Glycine (14.5 g Tris, 80 g glycine auf 500 ml Endvolumen)
1M Tris-HCl, pH 6.8
2X urea-Probenpuffer

Trenngel (10 ml)

4.8 g urea (für 8 M Endkonzentration)
1.9 ml 40% Acrylamid
833 µl 240mM Tris-glycine
mit MQ auf 10 ml auffüllen
6.6 µl TEMED
12,5 µl 40% APS

Sammelgel (10 ml)

4.8 g urea
870 µl 40% Acrylamid
1,43 ml 0,5M Tris pH 6.8
mit MQ auf 10 ml auffüllen
10 µl TEMED
12,5 µl 40% APS

Lauf-Puffer

83.3 ml of 240 mM Tris-glycine diluuted to 1L in water