Virusamplifikation

Abkürzungen:

MOI : multiplicity of infection, = plaque forming units pro Zelle
Pfu : plaque forming units

Virusamplifikation, schnell, mit 2. Transfektionsüberstand

75 cm² Zellkulturflaschen mit ca. 5 ml Medium füllen, Boden benetzen
5x10⁶ Zellen zugeben, verteilen
15 min adsorbieren lassen
Virussuspension des 2. Transfektionsüberstands auf Raumtemperatur kommen lassen, vortexen
Medium aus den Zellkulturflaschen abnehmen, sofort 1 ml Virussuspension aus dem Transfektionsüberstand, aufgefüllt mit Medium auf 3ml, zugeben, Nullwert (nur Medium) mit ansetzen!
1h bei 27°C inkubieren, alle 15 min bewegen
9 ml Medium (27°C) zugeben (neue Pipette für jede Flasche)
4 Tage bei 27°C inkubieren
Überstand nach Zentrifugation (5000 rpm, 10 min.) als P1* bezeichnen

weiter im Spinner:
125ml Zellensuspension mit ca.1,25x10⁸Zellen
Zellen (in 50ml Falcons)abzentrifugieren, 1800 rpm, 10 min., RT
Zellpellets in 10ml P1*(+2,5ml Medium) resuspendieren und in den Spinner zurückpipettieren,
1h bei 27°C inkubieren, alle 15 min. bewegen
mit Medium auf 100ml auffüllen
5 Tage 27°C
Zellen zählen, zentrifugieren: 5000 rpm, 10 min., RT
Überstand als P3* bezeichnen, im Kühlschrank aufbewahren.

Virusamplifikation nach dem Picken von Plaques

25 cm² Zellkulturflaschen mit ca. 3 ml Medium füllen, Boden benetzen
1x10⁶ Zellen zugeben, verteilen
15 min adsorbieren lassen
Virussuspension der Plaques auf Raumtemperatur kommen lassen, vortexen
Medium aus den Zellkulturflaschen absaugen (Pasteurpipette, Vakuumpumpe), sofort 1 ml Virussuspension aus den Plaques zugeben, Nullwert (nur Medium) mit ansetzen!
1h bei 27°C inkubieren, alle 15 min bewegen
4 ml Medium (27°C) zugeben (neue Pipette für jede Flasche)
4 Tage bei 27°C inkubieren

Zellen abschlagen

Nach 4 Tagen Inkubation werden die Zellen und die Virusüberstände geerntet. Die virusinfizierten Zellen sind größer, wachsen wesentlich schlechter bzw. lysieren, und heften sich nicht am Boden an.

Flaschen leicht schräg halten und mit der flachen Hand jeweils kräftig einige Male an die Schmalseite der Flasche schlagen. Schaumbildung vermeiden
Medium mit 5ml-Pipette absaugen, Boden der Zellkulturflasche damit spülen
Sollen Zellpellets untersucht werden, < 1000 g (2300 rpm) zentrifugieren; wird nur der Überstand gebraucht, bei max. Drehzahl zentrifugieren (5000 rpm)
Überstand wird als P1 bezeichnet und kann im Kühlschrank verwahrt werden. Pellets (ev. in flüssigem N₂) einfrieren und bei -20°C bis zur Elektrophorese aufheben

Weitere Virusamplifikation

in 75 cm² Zellkulturflasche 5 ml Medium vorlegen und 5x10⁶ Zellen zugeben, 15 min. anheften lassen
Medium abnehmen
infizieren wie oben beschrieben mit ca. 300 µl P1 + 3 ml Medium
nach einer Stunde Inkubation 9 ml Medium zugeben
wird 4 Tage bei 27°C inkubiert
nach 4 Tagen werden die Zellen abgeschlagen, 10 min. bei RT und 2300 rpm zentrifugiert und der Überstand im Plaque-Assay getestet

Der Überstand wird als P2 bezeichnet und hat ca. 1-2×10⁷ Pfu/ml Diese Methode hat den Vorteil, dass man mehr Virusüberstand P2 erhält, und die Infektion im Spinner ev. wiederholen kann.

Infektion im Spinner

um genügend Virusüberstand für einige Proteinexpressionen zu erhalten

Spinnerflasche mit ca. 2x10⁸ Zellen in ca. 200 ml
Zellen (verteilt auf 4 Falcons a 50 ml) bei 1800 rpm, 20°C, 10 min abzentrifugieren
Pellets (übers Gitter der Sterilbank ziehen, 25ml-Pipette) in ca. 20 ml Medium mit Virusüberstand P2, MOI 0,1-0,2 resuspendieren
1h in der Spinnerflasche inkubieren bei 27°C, alle 15 min schwenken
auf ca. 200 ml auffüllen, Zellen zählen (eventuell täglich)
nach 4-5 Tagen Inhalt des Spinners auf Falcons verteilen und 10 min zentrifugieren. Sollen Zellpellets untersucht werden, < 1000 g (2300 rpm) zentrifugieren; wird nur der Überstand gebraucht, bei max. Drehzahl zentrifugieren (5000 rpm)
vom Überstand wird Plaque-Assay durchgeführt und als P3 im Kühlschrank aufbewahrt

P3 hat einen Titer von ca. 1,7×10⁸ Pfu/ml