Virusamplifikation

Kurs- und Projektübersicht

• Biochem. Praktikum f. Fortgeschrittene
• Klonieren für Ungeduldige
• Molarität für Dummies
• Liste aller Wikiversity Kurse
• Liste aller Wikiversity Projekte

Methoden

• Molekular Biologische Methoden
• Biochemische Methoden
• Methoden Sf9-Zellkultur
• Material

Campus

• Suche
• Fachbereiche
• Bibliothek
• Cafeteria
• Kategorien
• Projektinkubator
• Systematik
• Bildrechte
• Namenskonventionen

Über Wikiversity

• Sprachen
• Presse
• Statistik
• Werbung
• Datenschutz
• Lizenzbestimmungen
• Impressum
• Was Wikiversity nicht ist

Hilfe

• Schnelleinstieg
• Beteiligen
• FAQ (Häufige Fragen)
• Fragen
• Bearbeitungshilfe
• Glossar

Abkürzungen:

• MOI : multiplicity of infection, = plaque forming units pro Zelle
• Pfu : plaque forming units

Virusamplifikation, schnell, mit 2. Transfektionsüberstand

1. 75 cm² Zellkulturflaschen mit ca. 5 ml Medium füllen, Boden benetzen
2. 5x10⁶ Zellen zugeben, verteilen
3. 15 min adsorbieren lassen
4. Virussuspension des 2. Transfektionsüberstands auf Raumtemperatur kommen lassen, vortexen
5. Medium aus den Zellkulturflaschen abnehmen, sofort 1 ml Virussuspension aus dem Transfektionsüberstand, aufgefüllt mit Medium auf 3ml, zugeben, Nullwert (nur Medium) mit ansetzen!
6. 1h bei 27°C inkubieren, alle 15 min bewegen
7. 9 ml Medium (27°C) zugeben (neue Pipette für jede Flasche)
8. 4 Tage bei 27°C inkubieren
9. Überstand nach Zentrifugation (5000 rpm, 10 min.) als P1* bezeichnen

1. weiter im Spinner:
2. 125ml Zellensuspension mit ca.1,25x10⁸Zellen
3. Zellen (in 50ml Falcons)abzentrifugieren, 1800 rpm, 10 min., RT
4. Zellpellets in 10ml P1*(+2,5ml Medium) resuspendieren und in den Spinner zurückpipettieren,
5. 1h bei 27°C inkubieren, alle 15 min. bewegen
6. mit Medium auf 100ml auffüllen
7. 5 Tage 27°C
8. Zellen zählen, zentrifugieren: 5000 rpm, 10 min., RT
9. Überstand als P3* bezeichnen, im Kühlschrank aufbewahren.

Virusamplifikation nach dem Picken von Plaques

1. 25 cm² Zellkulturflaschen mit ca. 3 ml Medium füllen, Boden benetzen
2. 1x10⁶ Zellen zugeben, verteilen
3. 15 min adsorbieren lassen
4. Virussuspension der Plaques auf Raumtemperatur kommen lassen, vortexen
5. Medium aus den Zellkulturflaschen absaugen (Pasteurpipette, Vakuumpumpe), sofort 1 ml Virussuspension aus den Plaques zugeben, Nullwert (nur Medium) mit ansetzen!
6. 1h bei 27°C inkubieren, alle 15 min bewegen
7. 4 ml Medium (27°C) zugeben (neue Pipette für jede Flasche)
8. 4 Tage bei 27°C inkubieren

Zellen abschlagen

Nach 4 Tagen Inkubation werden die Zellen und die Virusüberstände geerntet. Die virusinfizierten Zellen sind größer, wachsen wesentlich schlechter bzw. lysieren, und heften sich nicht am Boden an.

1. Flaschen leicht schräg halten und mit der flachen Hand jeweils kräftig einige Male an die Schmalseite der Flasche schlagen. Schaumbildung vermeiden
2. Medium mit 5ml-Pipette absaugen, Boden der Zellkulturflasche damit spülen
3. Sollen Zellpellets untersucht werden, < 1000 g (2300 rpm) zentrifugieren; wird nur der Überstand gebraucht, bei max. Drehzahl zentrifugieren (5000 rpm)
4. Überstand wird als P1 bezeichnet und kann im Kühlschrank verwahrt werden. Pellets (ev. in flüssigem N₂) einfrieren und bei -20°C bis zur Elektrophorese aufheben

Weitere Virusamplifikation

2. in 75 cm² Zellkulturflasche 5 ml Medium vorlegen und 5x10⁶ Zellen zugeben, 15 min. anheften lassen
3. Medium abnehmen
4. infizieren wie oben beschrieben mit ca. 300 µl P1 + 3 ml Medium
5. nach einer Stunde Inkubation 9 ml Medium zugeben
6. wird 4 Tage bei 27°C inkubiert
7. nach 4 Tagen werden die Zellen abgeschlagen, 10 min. bei RT und 2300 rpm zentrifugiert und der Überstand im Plaque-Assay getestet

Der Überstand wird als P2 bezeichnet und hat ca. 1-2×10⁷ Pfu/ml Diese Methode hat den Vorteil, dass man mehr Virusüberstand P2 erhält, und die Infektion im Spinner ev. wiederholen kann.

Infektion im Spinner

um genügend Virusüberstand für einige Proteinexpressionen zu erhalten

1. Spinnerflasche mit ca. 2x10⁸ Zellen in ca. 200 ml
2. Zellen (verteilt auf 4 Falcons a 50 ml) bei 1800 rpm, 20°C, 10 min abzentrifugieren
3. Pellets (übers Gitter der Sterilbank ziehen, 25ml-Pipette) in ca. 20 ml Medium mit Virusüberstand P2, MOI 0,1-0,2 resuspendieren
4. 1h in der Spinnerflasche inkubieren bei 27°C, alle 15 min schwenken
5. auf ca. 200 ml auffüllen, Zellen zählen (eventuell täglich)
6. nach 4-5 Tagen Inhalt des Spinners auf Falcons verteilen und 10 min zentrifugieren. Sollen Zellpellets untersucht werden, < 1000 g (2300 rpm) zentrifugieren; wird nur der Überstand gebraucht, bei max. Drehzahl zentrifugieren (5000 rpm)
7. vom Überstand wird Plaque-Assay durchgeführt und als P3 im Kühlschrank aufbewahrt

P3 hat einen Titer von ca. 1,7×10⁸ Pfu/ml