Co-Transfektion

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Einführen von Plasmid-DNA in BaculoGold™ (oder hier) DNA-Virus

Methode[Bearbeiten]

Vorbereitung[Bearbeiten]

  • 25 cm2 Kulturflaschen
  • Falcons
  • 10 µl-Pipette (mit Ethanol abwischen)
  • 1000 µl-Pipette (mit Ethanol abwischen)
  • sterile Eppis (1,5 ml)
  • 5 ml Sterilpipetten
  • Pipettenspitzen blau und kristall
  • Abfallbehälter für Zellen und Pipettenspitzen
  • Medium TNM-FH mit 10% FCS oder Grace's Insect Medium + 10%FCS + AB
  • Sf9-Zellen, 1*106
  • Transfektionspuffer A und B
  • Virus-DNA 0,25 µg
  • Plasmid-DNA 1 µg

Durchführung[Bearbeiten]

1× Nullwert (ohne Plasmid-DNA und Virus-DNA), 1× Transfektion

  1. Kulturflaschen mit 3 ml Medium benetzen
  2. Sf9-Zellen dazugeben, verteilen
  3. 15 min absorbieren lassen
  4. unter dem Mikroskop kontrollieren
  5. zwischendurch: Virus-DNA und Plasmid-DNA in ein Eppi geben, durch "Schnippen" mischen, 5 min stehenlassen
  6. Nullwert:
    1. Medium absaugen
    2. 0,5 ml Transfektionspuffer A seitlich in die Flasche geben
    3. 0,5 ml Transfektionspuffer B tropfenweise seitlich in die Flasche geben (je 2 Tropfen, schwenken)
  7. Transfektion:
    1. Medium absaugen
    2. 0,5 ml Transfektionspuffer A seitlich in die Flasche geben
    3. 0,5 ml Transfektionspuffer B in Eppi mit DNA geben, tropfenweise seitlich in die Flasche geben (je 2 Tropfen, schwenken)
  8. bei 27°C im Brutschrank für 4h inkubieren, stündlich Flasche schwenken
  9. Medium absaugen und durch 2,5 ml frisches Medium ersetzen
  10. 5 Tage bei 27°C im Brutschrank inkubieren
  11. 1. Überstand abnehmen, zur Kontrolle im Kühlschrank aufbewahren, zentrifugieren bei 2300 rpm, 10 min, RT, →Plaque-Assay
  12. 2,5 ml frisches Medium dazugeben
  13. 2 Tage bei 27°C im Brutschrank inkubieren
  14. Zellen abschlagen
  15. zentrifugieren bei 2300 rpm, 10 min, RT
  16. 2. Überstand abnehmen, zur Kontrolle im Kühlschrank aufbewahren, →Plaque Assay