Co-Transfektion
Einführen von Plasmid-DNA in BaculoGold™ (oder hier) DNA-Virus
Methode
[Bearbeiten]Vorbereitung
[Bearbeiten]- 25 cm2 Kulturflaschen
- Falcons
- 10 µl-Pipette (mit Ethanol abwischen)
- 1000 µl-Pipette (mit Ethanol abwischen)
- sterile Eppis (1,5 ml)
- 5 ml Sterilpipetten
- Pipettenspitzen blau und kristall
- Abfallbehälter für Zellen und Pipettenspitzen
- Medium TNM-FH mit 10% FCS oder Grace's Insect Medium + 10%FCS + AB
- Sf9-Zellen, 1*106
- Transfektionspuffer A und B
- Virus-DNA 0,25 µg
- Plasmid-DNA 1 µg
Durchführung
[Bearbeiten]1× Nullwert (ohne Plasmid-DNA und Virus-DNA), 1× Transfektion
- Kulturflaschen mit 3 ml Medium benetzen
- Sf9-Zellen dazugeben, verteilen
- 15 min absorbieren lassen
- unter dem Mikroskop kontrollieren
- zwischendurch: Virus-DNA und Plasmid-DNA in ein Eppi geben, durch "Schnippen" mischen, 5 min stehenlassen
- Nullwert:
- Medium absaugen
- 0,5 ml Transfektionspuffer A seitlich in die Flasche geben
- 0,5 ml Transfektionspuffer B tropfenweise seitlich in die Flasche geben (je 2 Tropfen, schwenken)
- Transfektion:
- Medium absaugen
- 0,5 ml Transfektionspuffer A seitlich in die Flasche geben
- 0,5 ml Transfektionspuffer B in Eppi mit DNA geben, tropfenweise seitlich in die Flasche geben (je 2 Tropfen, schwenken)
- bei 27°C im Brutschrank für 4h inkubieren, stündlich Flasche schwenken
- Medium absaugen und durch 2,5 ml frisches Medium ersetzen
- 5 Tage bei 27°C im Brutschrank inkubieren
- 1. Überstand abnehmen, zur Kontrolle im Kühlschrank aufbewahren, zentrifugieren bei 2300 rpm, 10 min, RT, →Plaque-Assay
- 2,5 ml frisches Medium dazugeben
- 2 Tage bei 27°C im Brutschrank inkubieren
- Zellen abschlagen
- zentrifugieren bei 2300 rpm, 10 min, RT
- 2. Überstand abnehmen, zur Kontrolle im Kühlschrank aufbewahren, →Plaque Assay