Colony PCR

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Die Colony-PCR ist eine einfache Methode, um den Erfolg einer Ligation zu überprüfen. Voraussetzung ist, dass für das Insert Primer vorhanden sind.

Template[Bearbeiten]

Als Template reichen sehr wenige Bakterien. Diese werden durch den anfänglichen 95°C-Schritt des PCR-Programms aufgeschlossen, so dass ihre DNA zugänglich ist. Zu viele Zellen können allerdings durch ihre übrigen Bestandteile den PCR-Prozess stören. Es kann auch präparierte DNA benutzt werden.

Wenige µl einer Flüssigkultur bzw. eine Kolonie werden auf 10 µl mit MQ verdünnt und für 5 min bei 95°C denaturieren (Heizblock oder PCR-Maschine). Mehrere Kolonien können so im selben PCR-Block überprüft werden. Zur Kontrolle kann ein weiterer PCR-Ansatz mit dem Template der originalen Insert-PCR gefahren werden.

PCR-Ansatz (REDTaq™)[Bearbeiten]

  • 12 µl 2× REDTaq ReadyMix
  • 1 µl UP-Primer (100 ng/µl)
  • 1 µl DOWN-Primer (100 ng/µl)
  • 10 µl Template in MQ

PCR-Programm[Bearbeiten]

# Min Sec °C Vorgang Zyklen
1. 0 45 96 Denaturieren 20-40×
2. 0 45 55+ Annealing
3. 0 30+ 72 Elongation
4. 10 0 72 Last Extension
5. 4 Hold