DNA-Extraktion aus Agarose-Gel

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Zur Reinigung von DNA über ein Agarose-Gel.

UltraClean 15, DNA Purification Kit[Bearbeiten]

  1. Bestimmung des Gewichts der Gelbande in einem 1,5-2,0 ml Eppendorfgefäß.
  2. Für TAE Gele: Zugabe von 3 Volumen ULTRA SALT. Gut mischen.
  3. Nach Salzzugabe wird das Gelstück bei 55°C-65°C inkubiert.
  4. Nachdem das Gelstück komplett geschmolzen ist wird 5 µl plus 1 µl per µg DNA ULTRA BIND hinzugefügt. Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
  5. Zentrifugation für 5 Sekunden. Überstand wird abgenommen und das Pellet mit 1 ml ULTRA WASH für 5-10 Sekunden vortexen.
  6. Zentrifugation für 5 Sekunden. Überstand verwerfen und noch mal 5 Sekunden zentrifugieren.
  7. Lösen des DNA-Pellets in Wasser oder TE-Puffer.

QIAEX II Gel Extraction Kit (150)[Bearbeiten]

  1. DNA-Bande mit sauberem, scharfen Skalpell aus dem Gel ausschneiden
  2. Leeres Eppi wiegen, ausgeschnittene Gelbande hineingeben, erneut wiegen
  3. 300 µl Puffer QX1 pro 100 mg Gel hinzugeben (wenn DNA-Fragment 100-4000 bp groß ist; wenn nicht, siehe Tabelle im Original-Protokoll)
  4. QIAEX II 30 sec resuspendieren durch vortexen
  5. 10 µl QIAEX II bei <=2 µg DNA hinzugeben, 30 µl QIAEX II bei 2-10 µg DNA
  6. Für 10 min bei 50°C inkubieren, alle 2 min vortexen
  7. Zentrifugieren 30 sec, 10.000g
  8. Überstand verwerfen
  9. Mit 500 µl Puffer QX1 waschen, vortexen
  10. Zentrifugieren 30 sec
  11. Überstand verwerfen
    1. Mit 500 µl Puffer PE waschen, vortexen
    2. Zentrifugieren 30 sec
    3. Überstand verwerfen
  12. An der Luft trocknen lassen, bis das Pellet weiß wird (10-15 min)
  13. Mit 20 µl MQ oder TRIS-HCl (10 mM, pH 8.8) resuspendieren
  14. Zentrifugieren 30 sec
  15. Überstand weiterverwenden (alternativ ab #14 wiederholen für höhere Ausbeute)

Filtermethode[Bearbeiten]

Geeignet für kurze DNA-Fragmente.

Vorbereitung des Gels[Bearbeiten]

Die DNA sollte zwecks effizienterer Extraktion auf möglichst wenige Slots verteilt werden. Daher reichlich Gel ansetzen und die Gießkammer bis zum Rand fülle (kleines Gel: 25 ml). In einen großen Slot eines solchen Gels passen knapp 40 µl. Für größere Volumina können vor dem Gießen zwei Zacken eines Kamms durch Tesa-Film miteinander verbunden werden. Zwei so verbundene große Slots fassen nun ca. 80 µl.

Vorbereitung der Extraktion[Bearbeiten]

  1. Das Gel wird photographiert (nur kurz mit UV belichten!)
  2. Das Gel wird auf einen UV-Tisch gelegt. Die gewünschten Banden werden mit einem Skalpell ausgeschnitten.
  3. Die Extraktions der DNA aus den Gelstücken erfolgt über Zentrifugation und Filtration.
  4. Mit einer dünnen Kanüle werden von innen drei Löcher in den Boden eines 1,5ml-Eppis gestochen.
  5. Ein ca. 1x1 cm großes Stück Munktell-Filterpapier wird entlang der Diagonalen gefaltet, dann noch einmal entlang der Senkrechten.
  6. Durch drücken der Enden klappt ein Mini-Filter auf. Die überstehenden Ecken werden mit der Schere entfernt.
  7. Der Mini-Filter wird in das Eppi gedrückt (am besten mit einer Pipettenspitze), so dass er den Boden bedeckt.
  8. Das Eppi wird nun in ein anderes 1,5ml-Eppis gesteckt. Bei beiden Eppis wird der Deckel entfernt.

Extraktion[Bearbeiten]

  1. Das ausgeschnittene Gelstück wird in das obere Eppi (mit dem Filter) gelegt.
  2. Zentrifugation für 1-5 min bei 4°C und maximaler Drehzahl
  3. Verwerfen des Eppis mit dem Gelstück. Abhängig vom Totalvolumen der Flüssigkeit:
    1. Hinzufügen von 3M NaOAc (0,1x des Totalvolumens)
    2. Hinzufügen von Isopropanol (0,7x des Totalvolumens)
    3. Hinzufügen von 2 µl Glycogen-Lösung zur Sichtbarmachung des DNA-Pellets
  4. Zentrifugation für 30 min bei 4°C und maximaler Drehzahl
  5. Die Flüssigkeit wird verworfen (nicht das Pellet!)
  6. Hinzufügen von 1 ml kaltem 70% EtOH
  7. Zentrifugation für 10 min bei 4°C und maximaler Drehzahl
  8. Die Flüssigkeit wird verworfen (nicht das Pellet!)
  9. In 15 µl MQ oder TE-Puffer aufnehmen

Materialien[Bearbeiten]

  • Agarose-Gel-Material (siehe Agarosegel), ggfs. Tesa-Film
  • Kanüle, Munktell-Filterpapier, 1,5ml-Eppis, Tischzentrifuge
  • 3M NaOAc, Isopropanol, 70% EtOH kalt
  • ggfs. Glycogenlösung, MQ oder TE-Puffer