Zum Inhalt springen

Institut:Biochemie/SDS-PAGE

Aus Wikiversity

Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen.

Methode

[Bearbeiten]
  1. 10 ml Trenngel (+APS +TEMED) in Kassette geben
  2. mit etwas MQ bedecken
  3. warten bis das Gel fest wird (ca. 45 min)
  4. MQ abgießen oder mit Filterpapier entfernen
  5. Kassette mit Sammelgel (+APS +TEMED) füllen (ca. 5 ml)
  6. Kamm einsetzen
  7. warten bis das Gel fest wird (ca. 30 min)
  8. währenddessen Heizblock auf 95°C stellen, Proben ca. 5 min kochen
  9. Unterseite der Slots mit Stift markieren
  10. Kamm und Klebestreifen entfernen
  11. Kassette in Laufkammer stellen (Slots zur Mitte hin orientieren)
  12. Mitte der Laufkammer mit SDS-Laufpuffer füllen, so dass die Slots bedeckt sind; es darf kein Puffer auslaufen
  13. den äußeren Bereich der Kammer zu etwa 1/3 mit Laufpuffer füllen
  14. Proben mit Hamilton-Pipette in die Slots geben, nach jeder Probe in SDS-Laufpuffer spülen
  15. mit 20 mA laufen lassen, bis die Proben das Sammelgel verlassen haben, dann mit 30 mA im Trenngel
  16. Hamiltonpipette mit Ethanol spülen
  17. Gel entfernen, wenn die Lauffront sich dem unteren Ende nähert
  18. Kammer in den Ausguss entleeren, mit Wasser spülen

Weitere mögliche Schritte:

  • Gel auf Lichttisch fotographieren
  • Western Blot
  • Gel trocknen
    1. Gel und Einmach-Folie in MQ legen
    2. Gel auf die feuchte Folie legen, Folie umklappen, so daß sie das Gel von beiden Seiten komplett bedeckt
    3. Gel in Folie zwischen zwei Pappdeckel legen
    4. auf Vakuumtisch legen, Vakuumpumpe einschalten (Waschflasche auf Eis stellen!)
    5. mit Vakuum für ca. 1 h mit Hitze, danach für ca. 15 min ohne Hitze trocknen
    6. falls das Gel zu früh entnommen wird (wellig), ca. 1 h in MQ einlegen, erneut trocknen

Materialien

[Bearbeiten]
Trenngel
[ml] 7% 10% 12% 15% 18% 100ml
12%
3M TRIS, pH 8,8 1,85 1,85 1,85 1,85 1,85 18,5
20% SDS 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,5
60% D(+)-Saccharose 1,15 1,15 1,15 1,15 1,15 11,5
50% Acrylamid (100:2,7)
MQ
1,40
5,55
2,00
4,95
2,40
4,55
3,00
3,95
3,60
3,35
24,0
45,5
40% Acrylamid (37,5:1)
MQ
1,75
5,20
2,50
4,45
3,00
3,95
3,75
3,20
4,50
2,45
30,0
39,5
30% Acrylamid (100:2,7)
MQ
2,30
4,65
3,30
3,65
4,0
2,95
5,00
1,95
6,00
0,95
40,0
29,5
10 ml Trenngel; + 10,4 µl APS + 4,4 µl TEMED
Sammelgel
[ml] 10 ml 50 ml 200 ml
4% 6% 4% 6% 4% 6%
0,5M TRIS pH 6,8 2,5 2,5 12,5 12,5 50 50
20% SDS 0,05 0,05 0,25 0,25 1 1
50% Acrylamid (100:1)
MQ
0,80
6,65
1,20
6,25
4,0
33,25
6,0
33,25
16
133
24
125
40% Acrylamid (37,5:1)
MQ
1,00
6,45
1,50
5,95
5,00
32,7
7,50
29,75
20
129
30
119
30% Acrylamid (100:2,7)
MQ
1,20
6,25
2,00
5,45
6,00
31,25
10,00
27,25
24
125
40
109
10 ml Sammelgel; + 12,5 µl APS + 10 µl TEMED
SDS-Laufpuffer 5×, 2l
mM TRIS (121,14 g/mol) 50 250   60,6g
% SDS 0,1 0,5   10,0g
mM Glycin (75,07 g/mol) 384 1920   288g

50% (Bis-)Acrylamid (100:2,7)

[Bearbeiten]
  • 48,65 g Acrylamid
  • 1,35 g Bis-Acrylamid
  • mit MQ auf ca. 75 ml auffüllen
  • Acrylamid vollständig auflösen
  • auf 100 ml auffüllen
  • durch 0,45 µM Filter geben

Andere Materialien

[Bearbeiten]
  • APS=40% Ammonium-Persulfat (0,1g auf 250 µl ansetzen, hält ca. 2-3 Tage)
  • SDS-Probenpuffer
  • ggfs. Einmach-Folie