Institut:Biochemie/Western Blot

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Beim Western Blot werden die Proteine aus einer SDS-PAGE auf eine PVDF-Membran übertragen. Dort können sie mit Hilfe von Antikörpern sichtbar gemacht werden.

Methode

Elektroblot

1. Variante

1. Die untere Graphitplatte (+, Anode) anfeuchten
2. 12 Munktell-Filter (5,5x8,5 cm) in 1x Blotpuffer getränkt als Unterlage, ggfs. mit Glaspipette glattstreichen
3. Membran kurz in Metanol aktivieren, in MQ wässern, in Blotpuffer legen
4. Membran auf die Munktell-Filter legen, Oberseite in einer Ecke mit Bleistift-Kreuz markieren
5. Gel auflegen
6. 12 Munktell-Filter (5,5x8,5 cm) in 1x Blotpuffer getränkt auflegen, ggfs. mit Glaspipette glattstreichen
7. Die obere Graphitplatte (-, Kathode) auflegen
8. mit 90 mA (~2mA pro cm² Gel) ca. 15 min. laufen lassen (abhängig von Protein und Gelgröße)

2. Variante

Auf der Blot-Apperatur aufbauen

1. 16 Munktell-Filter in Anodenpuffer Anodenpuffer I
2. 16 Munktell-Filter in Anodenpuffer Anodenpuffer II
3. Membran (kurz in Methanol aktivieren, in MQ wässern)
4. Gel
5. 16 Munktell-Filter in Kathodenpuffer

Blot: 20min bei 299mA (76V --> 62V) Vorsicht: Wenn seitlich Gasblasen aus dem Sandwich kommen abstellen!

Abklatsch

1. Glasplatte als Unterlage
2. Schritte 2-6 wie bei Elektroblot
3. Glasplatte Auflage
4. Für ca. 10 min eine gefüllte 1l-Flasche oder einen ähnlich schweren Gegenstand( bis Max. 5kg!) auf den Stapel stellen

Wet-Blot

Blot wird in der Vertikalen in Wet-Blot-Puffer durchgeführt. Vorteil: Protein wird komplett auf die Membran übertragen. Aufbau des Schlittens (in Draufsicht):

1. Schwamm (an Kathode)
2. 2× Munktell-Filter
3. SDS-Gel
4. PVDF-Membran
5. 2× Munktell-Filter
6. Schwamm (an Anode)

Schlitten in die Wet-Blot-Kammer (BioRad) einsetzen. 30 mA, über Nacht, 4°C.

Blotentwicklung (bei Verwendung des mit der Alkalischen Phosphatase gekoppelten 2.AK)

1. Bei Bedarf ca. 10 Minuten in Ponceau-Rot geben, mit Wasser abspülen, um alle Proteine vorrübergehend anzufärben
   Hinweis: Die Ponceaux-Färbung toleriert kein SDS, daher Membran ggf. vor der Färbung kurz in Methanol legen.
2. Blot abblocken (1h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C) mit
   • 2,5g Milchpulver in 50 ml 1x TBS-Puffer oder
   • 1% BSA/TBS (oder BSA/PBS) + 0,02%NaN₃ (d.h. 80 µl 25% NaN₃ auf 100 ml Lösung)
     [kann mehrmals verwendet werden; im Kühlschrank lagern]
3. TBS/Tween-Mix ansetzen (0,05% v/v Tween-20)
   • 50 µl Tween; Pipettenspitze vorher abschneiden!
   • 100 ml TBS; Endkonzentration 0,05% Tween
4. Blot 30 min mit TBS/Tween waschen; oft wechseln
5. Mit dem primären Antikörper* für 1h auf Schütteltisch inkubieren
6. 5x je 5 min mit TBS/Tween waschen
7. Mit dem sekundären Antikörper* für 1 h auf Schütteltisch inkubieren
8. 5x je 5 min mit TBS/Tween waschen
9. Entwickeln
   • 33 µl BCIP und 66 µl NBT in 10 ml Blot-Entwicklungspuffer in Schale geben
   • Blot einige Sekunden in Schale legen, bis Banden sichtbar werden
   • Abspülen mit Wasser stoppt enzymatische Reaktionen
10. Blot ist lichtempfindlich, daher in Alufolie aufbewahren

* Primärer und sekundärer Antikörper werden in TBS mit 1%BSA und 0,02% Na-Acid angesetzt und nach dem Gebrauch nicht verworfen (Aufbewahrung bei 4°C).

Materialien

Blotten

• 24 Munktell-Filter (5,5x8,5 cm)
• Milchpulver oder BSA

Blotpuffer	1l 1x	1l 5x
TRIS (Endkonzentration 50 mM)	6,055 g	30,275 g
Glycin (Endkonzentration 40 mM)	3,003 g	15,015 g
Mit MQ auffüllen, optional auf pH 9.1 einstellen

Elektroblot 2. Variante

• Anodenpuffer I: 0,3M Tris, 10% Methanol pH 10,4
• Anodenpuffer II: 25mM Tris, 10% Methanol, pH 10,4
• Kathodenpuffer: 25mM Tris, 10% Methanol, 40mM Glycin, pH 9,4

Wet-Blot-Puffer

1×, 2l

• 25 mM Tris (6,05g)
• 192 mM Glycin (28,8g)
• 20% Methanol tech. (400 ml)
• 0,02% SDS (0,4g = 2ml(20% SDS))

Blotentwicklung

Blot-Entwicklungspuffer	1000 ml	500 ml	250 ml
100 mM Tris (MW=121,4)	12,14 g	6,06 g	3,03 g
100 mM NaCl (MW=58,44)	5,884 g	2,92 g	1,46 g
5 mM MgCl2 . 6H2O (MW=203,3)	1,017 g	0,508 g	0,254 g
Mit MQ auffüllen, mit HCl auf pH 9.5 einstellen

• TBS-Puffer, Tween
• Primärer und sekundärer Antikörper
• BCIP (Brom-Chlor-Indoylphosphat) [100 mg in 2 ml DMF lösen => Endkonzentration 20 mg/ml]
• NBT (Nitro-Blue-Tetrazolium) [250 mg in 5 ml (3,5 ml DMF + 1,5 ml H₂O) lösen => Endkonzentration 50 mg/ml]
• DMF (DiMethylFormamid)
• ggfs. Ponceau-Rot

Hintergrund

• www.vu-wien.ac.at