Institut:Biochemie/Schägger-Gel

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Ein Schägger-Gel ähnelt einem SDS-Gel, trennt aber kleine Proteine bzw. Peptide besser auf. Im Gegensatz zum SDS-Gel besteht das Schägger-Gel aus drei statt zwei "Lagen".

Methode

1. Je 5 ml Trenngel und Spacergel mit APS+TEMED ansetzen
2. Das Trenngel in die Kassette geben, bis es die Kassette knapp über die Hälfte füllt
3. Nach 5 Minuten das Spacergel vorsichtig auf das Trenngel schichten, die Kassette dabei bis zur 3/4-Markierung füllen
4. Das Spacergel vorsichtig mit MQ überschichten
5. Nach ca. 45 Minuten das Wasser abgiessen
6. 5 ml Sammelgel mit APS+TEMED ansetzen
7. Die Kassette mit dem Sammelgel komplett füllen
8. Kamm einsetzten
9. 30 Minuten polymerisieren lassen
10. Währenddessen Heizblock auf 95°C stellen, Proben ca. 5 min kochen
11. Unterseite der Slots mit Stift markieren
12. Kamm und Klebestreifen entfernen
13. Kassette in Laufkammer stellen (Slots zur Mitte hin orientieren)
14. Mitte der Laufkammer mit Kathodenpuffer füllen, so dass die Slots gut bedeckt sind
15. Den äußeren Bereich der Kammer zu etwa 1/3 mit Anodenpuffer füllen
16. Proben mit Hamilton-Pipette in die Slots geben, nach jeder Probe in Kathodenpuffer spülen
17. Mit 40 Volt laufen lassen (bis zu 18 Stunden)
18. Hamiltonpipette mit Ethanol spülen
19. Gel entfernen, wenn die Lauffront sich dem unteren Ende nähert
20. Kammer in den Ausguss entleeren, mit Wasser spülen

Weitere mögliche Schritte:

• Gel auf Lichttisch fotographieren
• Western Blot
• Gel trocknen
  1. Gel und Einmach-Folie in MQ legen
  2. Gel auf die feuchte Folie legen, Folie umklappen, so daß sie das Gel von beiden Seiten komplett bedeckt
  3. Gel in Folie zwischen zwei Pappdeckel legen
  4. Auf Vakuumtisch legen, Vakuumpumpe einschalten (Waschflasche auf Eis stellen!)
  5. Mit Vakuum für ca. 3 h mit Hitze, danach für ca. 1 h ohne Hitze trocknen
  6. Falls das Gel zu früh entnommen wird (wellig), ca. 1 h in MQ einlegen, erneut trocknen

Materialien

Gele

Je 60 ml Endvolumen	Trenngel 16%	Spacergel 10%	Sammelgel 4%
30% Acrylamid	32 ml	20 ml	8 ml
3M Tris/0,3% SDS pH 8,45	20 ml	20 ml	15 ml
Glycerin	8 ml	0 ml	0 ml
MQ	0 ml	20 ml	37 ml
0,3% SDS = 0,18g SDS auf 60 ml 3M TRIS

Puffer

• Anodenpuffer
  • 0,2M TRIS (6 g auf 250 ml)
  • Mit HCl auf pH 8,9 einstellen
• Kathodenpuffer
  • 0,1M TRIS (3 g auf 250 ml)
  • 0,1M Tricine (4,5 g auf 250 ml)
  • 0,1% SDS (0,25 g auf 250 ml)
  • Mit HCl auf pH 8,25 einstellen