Institut:Biochemie/native PAGE

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Zur nicht-denaturierenden Proteinauftrennung.

Methode[Bearbeiten]

Basiert auf SDS-PAGE.

Unterschiede zur SDS-PAGE[Bearbeiten]

  • WICHTIG! Probenvorbereitung ohne SDS-Zugabe und Denaturierung bei 95°C! (die Proteine sollen im nativen Zustand verbleiben)
  • Nur mit Glasplatten-System
  • Dünne Spacer und Kämme verwenden
  • Trenngel polymerisiert in ca. 30 Minuten
  • Gekühlte Laufkammer (4°C) verwenden
  • Native PAGE Laufpuffer verwenden
  • Stromgeber-Einstellungen:
  • 1 Gel : 150 V (Gel läuft recht genau 90')
  • 2 Gele : 200 V

Materialien[Bearbeiten]

Natives Trenngel
8,5% 10 ml 200 ml
3M TRIS pH 8.8 1,85 ml 37 ml
60% Saccharose 1,15 ml 23 ml
50% Acrylamid
MQ
1,7 ml
5,3 ml
34 ml
106 ml
40% Acrylamid
MQ
2,1 ml
4,9 ml
42 ml
98 ml
30% Acrylamid
MQ
2,8 ml
4,2 ml
56 ml
84 ml
Natives Sammelgel
5% 10 ml 200 ml
0.5M TRIS, pH 6,8 2,5 ml 50 ml
50% Acrylamid
MQ
1,0 ml
6,5 ml
20 ml
130 ml
40% Acrylamid
MQ
1,2 ml
6,3 ml
24 ml
126 ml
30% Acrylamid
MQ
1,6 ml
5,9 ml
33 ml
117 ml
Native PAGE Laufpuffer
Laufpuffer 5×, 2L
mM TRIS 50 mM 250 mM   60,6g
mM Glycin 384 mM 1920 mM 288,3g
Probenpuffer
Probenpuffer 4×, 100µl
0,5 M EDTA 250 mM 50 µl
0,5 M Tris pH 6,8 375 mM 12,5 µl
60% Saccharose 16,5% 27,5 µl
1 M DTT 0,1 M 10 µl
etwas Bromphenolblau