Phosphoaminosäure-Analyse

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Phosphoaminosäure-Analyse (PASA), ausgehend von tryptische eluierten Enzymen.

Vorbereitung der Proben (2 Tage)

1. Peptide unter Speed-Vac einengen (Dauer: ca. 1 Tag / Nacht)
2. Getrocknete Peptide mit 200µl 6N HCl (ohne Dichtekorrektur) für 2h bei 110°C inkubieren.
3. Danach Proben auf Eis abkühlen.
4. Falls "Verbrennungsrückstände" auftreten (Schwebteilchen etc., können z.B. von Gelfragmenten herrühen), Probe scharf zentrifugieren (4°C) und nur Überstand weiterverwenden
5. HCl unter HCl-SpeedVac abziehen.
6. Proben 2x in 50µl MQ lösen und erneut abziehen.
7. Cerenkov-Zählung und zu ca. 500-1000 cpm/µl lösen (bei unter ~<1000 cpm in ca. 2µl lösen)

Anschließend Auftrennug der Phosphoaminosäuren nach einer der folgenden Methoden:

1D Dünnschicht-Chromatographie (DC) auf Kieselgel (4h)

1. Auf der Kieselgelplatte in ca 2 cm Höhe eine Linie (mit Bleistift) ziehen und Probenauftragspunkte markieren.
2. ca. 500-1000cpm (es funktionieren auch weniger) pro Probe auftragen.
3. Links und rechts der Proben, jeweils 0,5µl des pThr-pTyr-pSer-Standards auftragen.
4. Auf jeden Probenauftrag ebenfalls 0,5µl Standard auftropfen.
5. Platte kurz trocknen lassen.
6. Laufkammer mit DC-Laufpuffer ca 1,5cm hoch füllen.
7. Platte reinstellen und Laufkammer mit Deckel und Handschuh abdichten.
8. 3 x 1h Stunde laufen lassen. Nach jeder Stunden, Platte bei 50°C trocknen lassen und DC-Laufpuffer wechseln.
9. Standards durch Besprühen mit 0,2 % (w/v) Ninhydrin in Ethanol und anschließender Inkubation bei 80°C sichtbar machen.
10. Platte nach Lauf mit Phosphoimager oder Autoradiographie auswerten.

DC-Laufpuffer
Ethanol (2,19 Teile)	68,7 ml
25% (w/v) Ammoniumhydroxid	31,3 ml
	< 100ml

1D Dünnschicht-Elektrophorese auf Cellulose

1D-Elektrophorese läuft bei 1000V const. für 20-25 min. Die Stromstärke sollte im Bereich von 10-15 mA liegen. Laufpuffer ist ein Ameisensäure-Eisessig-MQ Gemisch.

1. Nach Laufstopp wird mit einer Ninhydrin-Lösung die Membran besprüht und anschließend im Trockenschrank bei 80°C für 5 min. getrocknet. Es tritt eine

Färbung des Standards ein, die eine Kontrolle ermöglicht.

1. Zur Auswertung der Platte wird diese über Nacht in die GS-505 Sample Exposure Platform aufbewahrt und am nächsten Tag im Phospho-Imager analysiert.
2. Die DC läuft über 3h in einer DC-Kammer. Als Puffer dient ein Ethanol-Ammoniak-Gemisch. Der Puffer wird stündlich getauscht.
3. Nach Beendigung des Laufes wird die Platte getrocknet und wie oben beschrieben behandelt.

Der hauptsächliche Unterschied zwischen diesen Methoden besteht darin, dass die 1D-Elektrophorese ein sehr schnelles Instrument gg. der DC ist. Allerdings erlaubt die DC eine sehr viel saubere Auftrennung. Zudem ist die Reihenfolge der Auftrennung bei der 1D-Elektrophorese vom Auftrag ausgegangen: Peptidgemisch, Phospho-Tyrosin, Phospho-Serin/Threonin und freies P_i und dies ist genau umgekehrt bei der DC, da hier nicht nach der Größe, sondern nach Polarität aufgetrennt wird.

2D Dünnschicht-Elektrophorese auf Cellulose

1. Fortsetzung von 1D
2. Membran entfernen und unter dem Abzug trocknen (>10 min)
3. Elektrophorese-Apparatur reinigen und erneut mit Silikonöl beschichten
4. Getrocknete Membran um 90° Richtung Kathode ("nach links!") gedreht auflegen
5. Filterpapiere mit 2D-Puffer getränkt an den Enden auf die Membran legen
6. Bei 1000V const. für ca. 10-15 min laufen lassen

1D-/2D-Puffer (Cellulose)

	1D-Puffer	2D-Puffer
HCOOH	5 ml	---
Pyridin	---	1 ml
CH3COOH	15,6 ml	10 ml
mit MQ auf 200 ml auffüllen

Materialien

• Ninhydrinlösung : 0,2% (w/v) in Aceton oder Ethanol
• Ameisensäure-Eisessig-MQ : Ameisensäure 88%/Eisessig/MQ 5:15,6:179,4 pH 1,9
• Ethanol-Ammoniak-Gemisch : 96% Ethanol/25 % NH₃ (fl.) 3,5:1,6

Übereinanderlegen von Platten-Scan und Phosphoimager-Bild

1. Beide Bilder in Photoshop öffnen
2. Im Phosphoimager-Bild "Image/Adjustments/Auto Contrast" auswählen, um das Bild sichtbar zu machen
3. Im Phosphoimager-Bild "Image/Mode/8 Bits/Channel" auswählen, um beide Bilder in der Farbtiefe kompatibel zu machen
4. Im Platten-Scan "Image/Image Size" auswählen, Wert "Resolution" merken, Dialog schließen
5. Im Phosphoimager-Bild "Image/Image Size" auswählen
   1. "Constrain proportions" muss aktiviert sein
   2. Unter "Resolution" den eben gemerkten Wert eintragen
   3. Unter "Width" die exakte Breite des Phosphoimager-Bildes eintragen (abzulesen am Phosphoimager-Originalbild)
   4. Dialog mit "OK" beenden
6. Im Phosphoimager-Bild alles markieren (Strg-A) und kopieren (Strg-C)
7. Im Platten-Scan "Layer/New/Layer" auswählen
8. Das kopierte Bild einfügen (Strg-V)
9. In der Layer-Palette "Opacity" regeln (z.B. auf 35), bis beide Bilder gut sichtbar sind
10. In der Werkzeug-Palette das Auswahl-Verschiebe-Werkzeug anwählen (Pfeil mit Kreuz; oberste Zeile rechts)
11. Das eingefügte Phosphoimager-Bild zur Deckung verschieben