Tryptische Elution

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Tryptische Elution von Proteinen aus SDS-PAGE.

Methode

Mit Hilfe dieser Methode werden Proteine im SDS-Gel tryptisch verdaut und aus dem Gelstück eluiert (ROSENFELD et al.,1992, AL-HASANI 1995). Diesen eluierten Peptide können dann zur weiteren Analyse einer Phosphoaminosäurenanalyse (PASA) unterzogen werden.

1. Phosphorylierungsansatz gelelektrophoretisch auftrennen, Gel trocknen und Autoradiographie durchführen
2. Banden aus dem Gel ausschneiden, wobei der Autoradiographiefilm als Vorlage dient
3. Messung der Cerenkov-Strahlung
4. Gelstücke in 500µl MQ wässern, Folie entfernen, MQ entfernen
5. Gelstücke 5*5min einwirken lassen bis die Gelstücke milchig-trübe Färbung erlangen und stein hart sind (wenn es länger dauert dauert es halt länger)
6. Acetonitril abnehmen
7. Zugabe von 10 µl Trypsin-Lösung (1 mg/ml in 50 mM Ammoniumcarbonat-Lsg.(0,48 g in 100 ml MQ)) und 60µl 50 mM Ammoniumcarbonat-Lsg.
8. 30 min. bei 35°C schütteln
9. Alternative
   1. Gel 30 min in Peptidfärbelösung anfärben
   2. Gel 3x10 min wässern (also "bestmöglich")
   3. Banden aus dem Gel ausschneiden (Vorsicht: bei so kurz angefärbten Gelen sind nur die Hauptbanden zu erkennen. Sollte ein Protein teilweise shiften, so wird dies nicht bemerkt!!!!)n
   4. Gelstücke sehr klein schneiden und wie oben mit Acetonitril entwässern
10. Zugabe von 5 µl Trypsin und 160µl Ammoniumcarbonat
11. bei RT schütteln über Nacht
12. Zentrifugation in Tischzentrifuge, Überstand abnehmen und Gelstück Cerenkov-Messung. Überstand über Speed-Vac lyophilisieren
13. Messung der Cerenkov-Strahlung
14. 300 µl MQ auf das Gelstück geben
15. 1h bei 55 °C schütteln
16. abzentrifugieren, Überstand wieder abnehmen und und Gelstück Cerenkov-Messung. Überstand zum ersteren dazugeben und lyophilisieren
17. Messung der Cerenkov-Strahlung (mindestens 85 % der 1. Messung). Lagerung jetzt bei -20 °C möglich
18. Saure Hydrolyse mit Lyophilisat durchführen: Inkubation mit 200 µl 6N HCl (ohne Dichtekorrektur) bei 110°C für 2h
19. Sofort abkühlen auf Eis (ganzen Alu-Heizblock auf Eis stellen) und trocknen über Speed-Vac
20. 2x mit 30 µl MQ waschen und ebenfalls trocknen
21. Messung der Cerenkov-Strahlung und Lagerung bei -20°C

Fortfahren mit * Phosphoaminosäure-Analyse.