P oly-A crylamid-G el-E lektrophorese zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen.
Die Triton-PAGE ist eine Methode zwischen der klassischen SDS-PAGE und der native PAGE . Auch hier werden Proteine eher nach sekundären Kriterien, wie Ladung, Glykosilierung und Struktur aufgetrennt.
10 ml Trenngel (+APS +TEMED) in Kassette geben
mit etwas MQ bedecken
warten bis das Gel fest wird (ca. 45 min)
MQ abgießen oder mit Filterpapier entfernen
Kassette mit Sammelgel (+APS +TEMED) füllen (ca. 5 ml)
Kamm einsetzen
warten bis das Gel fest wird (ca. 30 min)
Unterseite der Slots mit Stift markieren
Kamm und Klebestreifen entfernen
Kassette in Laufkammer stellen (Slots zur Mitte hin orientieren)
Mitte der Laufkammer mit Nativem-Laufpuffer füllen, so dass die Slots bedeckt sind; es darf kein Puffer auslaufen
den äußeren Bereich der Kammer zu etwa 1/3 mit Laufpuffer füllen
Proben mit Hamilton-Pipette in die Slots geben, nach jeder Probe in Laufpuffer spülen
Laufzeit 90-120min bei 150mA bei 4°C
Hamiltonpipette mit Ethanol spülen
Gel entfernen, wenn die Lauffront sich dem unteren Ende nähert
Kammer in den Ausguss entleeren, mit Wasser spülen
Weitere mögliche Schritte:
Gel auf Lichttisch fotographieren
Western Blot
Gel trocknen
Gel und Einmach-Folie in MQ legen
Gel auf die feuchte Folie legen, Folie umklappen, so daß sie das Gel von beiden Seiten komplett bedeckt
Gel in Folie zwischen zwei Pappdeckel legen
auf Vakuumtisch legen, Vakuumpumpe einschalten (Waschflasche auf Eis stellen!)
mit Vakuum für ca. 1 h mit Hitze, danach für ca. 15 min ohne Hitze trocknen
falls das Gel zu früh entnommen wird (wellig), ca. 1 h in MQ einlegen, erneut trocknen
Natives Trenngel
8,5%
10 ml
200 ml
3M TRIS pH 8.8
1,85 ml
37 ml
20% Trition X-100
50 µl
1 ml
60% Saccharose
1,15 ml
23 ml
50% Acrylamid MQ
1,7 ml 5,3 ml
34 ml 106 ml
40% Acrylamid MQ
2,1 ml 4,9 ml
42 ml 98 ml
30% Acrylamid MQ
2,8 ml 4,2 ml
56 ml 84 ml
Natives Sammelgel
5%
10 ml
200 ml
0.5M TRIS, pH 6,8
2,5 ml
50 ml
20% Trition X-100
50 µl
1 ml
50% Acrylamid MQ
1,0 ml 6,5 ml
20 ml 130 ml
40% Acrylamid MQ
1,2 ml 6,3 ml
24 ml 126 ml
30% Acrylamid MQ
1,6 ml 5,9 ml
33 ml 117 ml
Native PAGE Laufpuffer
Laufpuffer
1×
5×
5×, 2L
mM TRIS
50 mM
250 mM
60,6g
mM Glycin
384 mM
1920 mM
288,3g
Probenpuffer
Probenpuffer
4×
4×, 100µl
0,5 M EDTA
250 mM
50 µl
0,5 M Tris pH 6,8
375 mM
12,5 µl
60% Saccharose
16,5%
27,5 µl
1 M DTT
0,1 M
10 µl
20% Trition X-100
0,1 %
0,5 µl
etwas Bromphenolblau
APS =40% Ammonium-Persulfat (0,1g auf 250 µl ansetzen, hält ca. 2-3 Tage)
ggfs. Einmach-Folie